動(dòng)物細(xì)胞核制備試劑盒（密度梯度法）

原理及特點(diǎn) 用高密度介質(zhì)來分離動(dòng)物軟體組織（如肝臟、脾臟等）細(xì)胞核是目前主流的方法，它是由 Chauveau 于 1956 年發(fā)明，其原理是細(xì)胞核的密度較大，在高速離心條件下（40 000g 1 小時(shí)）可在高密度介質(zhì)（2.2mol/l 蔗糖溶液）中沉降下來，從而達(dá)到與細(xì)胞質(zhì)其它成分分開的目的。該方法能通過一步離心得到較高純度的細(xì)胞核，得到廣泛應(yīng)用。本產(chǎn)品就是在 Chauveau 方法的基礎(chǔ)上優(yōu)化改進(jìn)而來，它具有下列特點(diǎn)：
1. 基于密度梯度分離，可有效去除細(xì)胞質(zhì)及其他細(xì)胞器，得到的細(xì)胞核純凈，
2. 加進(jìn)氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀等改變分離介質(zhì)滲透壓的物質(zhì)，減少了細(xì)胞核的脆性，增加了細(xì)胞核的完整性。
3. 精心調(diào)節(jié)了介質(zhì)的 pH，防止細(xì)胞核在分離過程中的聚集，還能保持細(xì)胞核的精細(xì)結(jié)構(gòu)
4. 快速，整個(gè)操作過程僅需 1 小時(shí)即可完成（對(duì)一個(gè)樣品而言）。
5. 提供染色試劑，可以在普通光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)純化的細(xì)胞核的純度。
6. 處理溫和，得到的細(xì)胞核中的大部分蛋白質(zhì)都具有活性，可以用于膠遲阻實(shí)驗(yàn)、酶活性分析細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、代謝和蛋白組學(xué)等的研究；也可用于超大片段 DNA 的純化。
7. 不但適用于動(dòng)物和植物培養(yǎng)細(xì)胞，還能用于實(shí)體組織（能用 Dounce 或Potter 勻漿器勻漿的組織均可）。
8. 一次微量提取足夠處理 0.1 克組織或 10E7 個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞，本產(chǎn)品足夠 50次微量提取。
運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸和保存，有效期一年
自備試劑 手動(dòng)或電動(dòng) Dounce 或 Potter 組織勻漿器（研磨杵和套管的空隙好為 0.1mm，如果小于細(xì)胞核的直徑，則會(huì)使細(xì)胞核破裂）、水平式低溫高速離心機(jī)、光學(xué)顯微鏡。
使用方法 一、準(zhǔn)備工作：先將溶液 A 的成分二（干粉）全部加入到溶液 A 成分一（溶液）中，搖晃溶解后得到 100mL 溶液 A。將溶液 B 的成分二（干粉）全部加入到溶液 B 成分一（溶液）中，搖晃溶解后得到 50mL 溶液 B。4℃放置不能超過 2 天，長(zhǎng)期放置需要放-20℃。

二、微量細(xì)胞核分離（放量提取各試劑的用量可以按比例放大）：
1. 對(duì)組織細(xì)胞：稱取 100~200 mg 新鮮組織（如動(dòng)物肝臟、腦、心肌和植物葉片等），用自備的 PBS 或生理鹽水洗凈血水，濾紙吸干，用剪刀或刀片將其剪為碎塊（好大小為 1cm3，過小反而不利于勻漿）放入小容量Dounce 或 Potter 玻璃勻漿器內(nèi)。
2. 對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞：用自備胰酶按標(biāo)準(zhǔn)方法消化培養(yǎng)細(xì)胞，PBS 洗滌，800×g5~10 分鐘離心收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)。每次微量提取需要 5 × 10E7 個(gè)細(xì)胞，加入 1.0 mL 預(yù)冷的溶液 A 重懸細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移到小容量 Dounce 或Potter 玻璃勻漿器內(nèi)，
3. 用 Dounce 或 Potter 組織勻漿器在冰上破碎組織或細(xì)胞。如果用手動(dòng)勻漿器，一般需要 20~30 次。如果用電動(dòng)勻漿器，一般需要處理 3-5 次，每次 5～10 秒鐘（轉(zhuǎn)速為 500r/min）。推薦使用的兩種勻漿器，空隙為 0.1 mm
4. 將勻漿液轉(zhuǎn)移到離心管中。如果勻漿液有可見的結(jié)締組織和未破碎的組織塊，可以用三層自備的紗布放在 1.5 mL 離心管管口，將勻漿液過濾進(jìn)入離心管。可取少量濾液涂在載玻片上制得涂片 A，自然干燥涂片以便染色做顯微鏡觀察。
5. 4℃，700-800×g 水平離心 5-10 分鐘。細(xì)胞核沉淀在收集管底部，棄上清?？扇∩倭可锨逡和吭谳d玻片上制得涂片 B，自然干燥涂片以便染色做顯微鏡觀察。
6. 加入 0.5 mL 預(yù)冷溶液 A 重懸沉淀。用預(yù)冷的勻漿器（用前需要將表面的組織洗去）重懸沉淀?？扇∩倭可锨逡和吭谳d玻片上制得涂片 C，自然干燥涂片以便染色做顯微鏡觀察。
7. 在水平型離心管中加入 0.5mL 預(yù)冷的溶液 B，然后靠管壁慢慢加入上步得到的重懸液。
8. 在 4℃ 23000g 離心 30 分鐘，管底的沉淀即為細(xì)胞核。
9. 小心吸棄上清液。注意：上清一般比較粘稠，好倒立一段時(shí)間。
10.用 0.5 mL 溶液 A 重懸沉淀。
11.在 4℃ 1500g 離心 5 分鐘，吸棄上清，沉淀即為純凈的細(xì)胞核?？梢灾苯邮褂?，也可以加等體積的自備甘油，混勻后放液氮或-70℃保存?？扇∩倭可蠎腋∫和吭谳d玻片上制得涂片 D，自然干燥涂片以便染色做顯微鏡觀察。
12.用本方法一般可以從 0.1g 肝臟組織中純化到 1-2×107 個(gè)細(xì)胞核。如果后續(xù)試驗(yàn)是 Western Blot 和 2D-膠電泳，可直接加入上樣緩沖液裂解細(xì)胞核后上樣。
三、顯微鏡檢測(cè)涂片，計(jì)算效率
1. 將干燥后的 A-D 四張涂片加入固定液固定 15 分鐘，晾干。
2. Giemsa 染液染 10 分鐘。
3. 自備蒸餾水漂洗數(shù)秒，用濾紙吸干水。
4. 用顯微鏡（40×）檢查涂片，細(xì)胞核將呈紫紅色，混雜的細(xì)胞質(zhì)為淺藍(lán)色碎片。根據(jù)每步細(xì)胞核的數(shù)量可以粗略估計(jì)回收效率。