細(xì)胞核蛋白提取試劑盒（溶脹法）

產(chǎn)品及特點(diǎn)DNA 只存在于細(xì)胞核內(nèi)，因此參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和 DNA 復(fù)制的蛋白質(zhì)主要存在于 細(xì)胞核中，要研究蛋白質(zhì)與 DNA 的相互作用，首先需要制備能夠與 DNA 作用的 天然細(xì)胞核蛋白質(zhì)。目前、細(xì)胞核蛋白質(zhì)制備方法一般都比較繁瑣，一次處理大量 樣品時(shí)尤其不便，為此本公司基于溶脹法原理開發(fā)了本產(chǎn)品，用于從哺乳動(dòng)物組織 和培養(yǎng)細(xì)胞核蛋白的溫和微量提取，它具有下列特點(diǎn)：

1. 提取制備過(guò)程簡(jiǎn)便，只需要一小時(shí)。

2. 實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，尤其適合同時(shí)處理多個(gè)樣品。

3. 可用于培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞，也可以用于新鮮組織細(xì)胞。

4. 提取步驟溫和，制備的核蛋白能保持天然活性，可以直接用于轉(zhuǎn)錄因子活性分 析、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(gel shift assay)、免疫共沉淀、Western Blotting、DNA 足跡圖實(shí)驗(yàn)和甲基化干擾實(shí)驗(yàn)酶活性測(cè)定等研究。

5. 1×10E6 個(gè)細(xì)胞中可以得到 50-70 ug 的核蛋白質(zhì)。

6. 只適用于哺乳動(dòng)物組織和培養(yǎng)細(xì)胞，不適用于植物和真菌等生物。
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 小扁盒包裝
動(dòng)物細(xì)胞溶脹液 LM91203 50 mL
動(dòng)物細(xì)胞核溶脹液 LM90613b 10 mL
使用手冊(cè) LM90613sc 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸和保存，有效期一年。

自備試劑 PMSF、DTT、PBS、胰酶溶液等

使用方法實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：取適當(dāng)量（根據(jù)樣品數(shù)量確定）的動(dòng)物細(xì)胞溶脹液和動(dòng)物細(xì)胞核溶脹 液到新的塑料瓶中，置于冰上預(yù)冷，并在使用前數(shù)分鐘內(nèi)同時(shí)向動(dòng)物細(xì)胞溶脹 液和動(dòng)物細(xì)胞核溶脹液中加入自備的 PMSF 和 DTT，使 PMSF 的最終濃度為 0.2 mM，DTT 的最終濃度為 1 mM。實(shí)驗(yàn)中所用試劑均需先預(yù)冷。 一、提取培養(yǎng)細(xì)胞和懸浮細(xì)胞細(xì)胞核：

1. 培養(yǎng)細(xì)胞：將覆蓋率為 55-65%的培養(yǎng)細(xì)胞用自備的胰酶溶液按標(biāo)準(zhǔn)的胰酶法 處理，然后刮到 1.5 mL 塑料離心管中，4℃ 600g 離心 3 分鐘，小心棄上清。 細(xì)胞數(shù)量在 5×10E5-7 個(gè)。細(xì)胞沉淀體積約 0.1mL。

2. 懸浮細(xì)胞：直接將 5×10E5-7 個(gè)懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 1.5 mL 塑料離心管中，4℃ 600g 離心 3 分鐘，小心棄上清。細(xì)胞沉淀體積約 0.1mL。

3. 用 1mL 自備的預(yù)冷的 PBS 緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，然后 4℃ 600g 離心 3 分 鐘，小心棄上清。注意：必須盡快用 PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞沉淀，否則沉淀細(xì) 胞產(chǎn)生的 CO2 將使局部 pH 減低產(chǎn)生毒性。

4. 在細(xì)胞沉淀中加入 1mL 預(yù)加了 PMSF 和 DTT 的動(dòng)物細(xì)胞溶脹液，用手指輕 柔彈管壁使細(xì)胞沉淀懸浮起來(lái)。不要用槍頭。

5. 冰浴 10 分鐘。如果有條件可以取少量樣品涂片，在顯微鏡下觀察，90%的細(xì) 胞將呈現(xiàn)氣球狀。如果沒(méi)有則繼續(xù)冰浴直到 90%的細(xì)胞呈現(xiàn)氣球狀。

6. 渦旋激烈震蕩 10-30 秒混勻。如果有 Dounce 玻璃勻漿器，也可以用預(yù)冷的 勻漿器勻漿 10-12 次。如果有條件可以取少量樣品涂片，在顯微鏡下觀察， 90%的細(xì)胞將破裂。如果未破裂細(xì)胞折光度高，并且沒(méi)有膨脹，則表示這些細(xì) 胞已經(jīng)死亡。如果這樣的細(xì)胞太多，則需要重新取樣。

7. 4℃ 1000g 離心 3 分鐘，小心棄上清。沉淀為細(xì)胞核，上清為胞漿成分，如 果需要可以留存上清。

8. 在細(xì)胞核沉淀中加入 100 μL 預(yù)加了 PMSF 和 DTT 的、預(yù)冷的動(dòng)物細(xì)胞核溶 脹液，輕彈離心管混勻，使沉淀懸浮起來(lái)。

9. 冰浴 20 分鐘。

10. 4℃ 1000g 離心 2 分鐘，小心收集上清液（細(xì)胞核提取物），可立即用于后續(xù) 的凝膠滯后實(shí)驗(yàn)、BCA 法蛋白濃度測(cè)定、活性檢測(cè)、SDS-PAGE 電泳、2D 電泳等實(shí)驗(yàn)，也可以分裝后放-70℃長(zhǎng)期保存。 說(shuō)明：本方法可以從 1×10E6 個(gè)細(xì)胞中得到 50-70 ug 的核蛋白質(zhì)。 二、對(duì)新鮮組織：

11. 將 100-150 mg 新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用手術(shù)剪將組織盡可能切成非常細(xì) 小的碎片，盡量去除脂肪組織和結(jié)締組織等非目的組織，用自備的 PBS 緩沖 液洗滌 2 次，離心后去上清。在組織沉淀中加入 400 uL 預(yù)加了 PMSF 和 DTT 的動(dòng)物細(xì)胞溶脹液，在預(yù)冷的玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿。勻漿需在冰浴或 4oC 進(jìn)行。

12. 勻漿后把勻漿液轉(zhuǎn)移到塑料離心管內(nèi)，用手指彈管壁使沉淀懸浮起來(lái)，冰浴放 置 10-20 分鐘，渦旋激烈震蕩 10 秒混勻。

13. 接下來(lái)按照步驟 7-10 操作，即得到新鮮組織細(xì)胞核蛋白提取物。