DNA甲基化修飾試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)本產(chǎn)品是亞硫酸氫鹽 DNA 修飾試劑盒（CAT#:100922）的升級(jí)版，亞硫酸氫鹽修 飾 DNA 時(shí)要求 DNA 必須在單鏈狀態(tài)，反應(yīng)還必須在低溫進(jìn)行，常規(guī)的修飾試劑盒由于 是在液相進(jìn)行，要在低溫下讓 DNA 不相互復(fù)性而保持單鏈狀態(tài)非常棘手，所以常規(guī)修飾 試劑盒的修飾效率一般都不高。此外，常規(guī)方法要切換反應(yīng)液，有多次沉淀步驟，使得 DNA 的回收率一般都不超過 50%。為克服這些缺點(diǎn)，本公司開發(fā)出了此產(chǎn)品，它具有下 列特點(diǎn)：

1．用包埋的樣品進(jìn)行所有操作，免去所有沉淀和純化步驟，極大簡(jiǎn)化了操作。

2．免去了 DNA 提取過程，所需實(shí)驗(yàn)材料比常規(guī)方法更少，最少幾個(gè)細(xì)胞都可以，極大 地節(jié)約了寶貴材料，尤其適用于珍稀材料。

3．包埋處理后，DNA 在整個(gè)操作過程中都處于最適于修飾的單鏈狀態(tài)，提高了修飾效 率。

4．DNA 包埋于包埋塊中，切換反應(yīng)液非常方便，而且 DNA 不會(huì)丟失，所以最終回收率 都在 90%以上。

5．適用于實(shí)體材料、懸浮細(xì)胞和純化好的 DNA 樣品。

6．本試劑盒足夠制備 150 多個(gè)10uL 包埋塊（如果用純化好的 DNA）或 25 個(gè) 10uL 包埋塊（如果用懸浮細(xì)胞）。 
DNA甲基化修飾試劑盒
規(guī)格及成分 成分 產(chǎn)品編號(hào) 小扁盒包裝(無墊)
甲基化修飾溶液 A 130301a 30 mL
包埋液 130301b 1.5 mL（藍(lán)蓋，低溫成分）
包埋塊裂解液 120655a 12.5 mL（低溫成分）
分子生物學(xué)級(jí)石蠟油 130306 25 mL
蛋白酶 K 溶液（10mg/mL） 80911 150 uL（紅蓋，低溫成分）
甲基化修飾溶液 B 成分一 100922b1 2.3 g×5（10mL ，棕色瓶）
甲基化修飾溶液 B 成分二 100922b2 110 mg×5（1.5mL 棕色管）
TE 緩沖液，pH 8.0 80934 125 mL
使用手冊(cè) 130301sc 1 份

自備試劑 超純水

DNA甲基化修飾試劑盒運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸及保存,蛋白酶 K 溶液、包埋液和包埋塊裂解液需低溫運(yùn)輸，-20℃保存。 有效期一年。

使用方法 一：準(zhǔn)備試劑  

1. 在裝有 2.3g 甲基化修飾溶液 B（簡(jiǎn)稱溶液 B，下同）成分一干粉的瓶中加入 3.9 mL 水和 0.9 mL 甲基化修飾溶液 A（簡(jiǎn)稱溶液 A，下同），搖晃溶解得到 4.8 mL 溶液 B 成分一。

2. 在裝有 110mg 溶液 B 成分二干粉的離心管中加入 1 mL 50℃預(yù)熱的超純水，搖晃 溶解，得到溶液 B 成分二。

3. 將 0.6 mL 溶液 B 成分二加入到 4.8 mL 溶液 B 成分一中，得到 5.4 mL 溶液 B， 冰上放置待用。未用完的溶液 B 下次不得再使用。

4. 每次實(shí)驗(yàn)前，將裝有 1.5 mL 包埋液的離心管在沸水浴上放置數(shù)分鐘直到變成溶液， 然后放 80℃待用。

二、對(duì)微量組織材料（如果材料足夠，可先純化 DNA，再直接進(jìn)入第三步）

1. 用常規(guī)的胰酶消化法處理動(dòng)物實(shí)體組織或培養(yǎng)細(xì)胞，得到濃度不超過 60 個(gè)細(xì)胞/uL

的單細(xì)胞 PBS 懸液。如果實(shí)驗(yàn)材料已經(jīng)是單細(xì)胞懸浮液（如卵細(xì)胞），則 PBS 洗滌后直接離心沉淀，再重懸在 PBS 中（濃度不超過 60 個(gè)細(xì)胞/uL）。注：本試劑盒不

含本步所需相關(guān)試劑，如胰酶消化液和 PBS。

2. 在一個(gè)自備的 2 mL 離心管中加入 3 uL 上步所得細(xì)胞懸液，再迅速滴加 7 uL 在80℃預(yù)熱的包埋液。注：不需要吹打混勻以免混合液在搶頭里面凝固。

3. 加入 500 uL 分子生物學(xué)級(jí)石蠟油，短暫離心后將離心管在沸冰浴中放 20 分。

4. 將離心管轉(zhuǎn)移到冰上放置 30 分鐘，低溫下包埋液和細(xì)胞混合液將凝固成 10uL 的包埋塊，包埋塊中將包含細(xì)胞的基因組 DNA 和蛋白質(zhì)組份。

5. 在包埋塊中加入 500 uL 包埋塊裂解液和 5 uL 蛋白酶 K 溶液（10mg/mL），短暫離心后 37℃保溫過夜，降解其中的蛋白質(zhì)組份。

6. 吸棄包埋塊之外的所有溶液（包括石蠟油），用 1mL TE 緩沖液室溫浸泡包埋塊 2 次，每次 15 分鐘。此步可去除殘留包埋塊裂解液和殘留的蛋白酶 K。

7. 酶切包埋塊中的基因組 DNA：選定不識(shí)別 PCR 靶片段的內(nèi)切酶（本試劑不提供該相關(guān)試劑），再用 100 uL 選定內(nèi)切酶的 1×緩沖室溫液浸泡包埋塊 15 分鐘，吸棄緩沖液后再加入 100 uL 選定內(nèi)切酶的 1×緩沖液和 50U 內(nèi)切酶，37℃保溫 2 小時(shí)。

8. 吸棄內(nèi)切酶反應(yīng)液，再加入 500 uL 新鮮配制的處理液 A（配制方法：100 uL 溶液A+400 uL 超純水）室溫放置 15 分鐘，重復(fù)此步一次。此時(shí) DNA 將呈單鏈。

9. 吸棄處理液 A 后，用 1 mL 新鮮配制的處理液 B（注：不是溶液 B，配制方法：50uL溶液 A+950 uL 超純水）室溫浸泡包埋塊 5 分鐘。

10.吸棄處理液 B 后，加入 750uL 石蠟油，然后沸水浴 20-30 秒，使 DNA 單鏈徹底彼此分開。

11.將離心管轉(zhuǎn)移到冰上放置 30 分鐘使包埋塊重新凝固，單鏈 DNA 將固化。

12.在離心管中加入 1mL 預(yù)冷的溶液 B，短暫離心后繼續(xù)在冰上放置 30 分鐘。此步用于修飾固化的單鏈 DNA。

13.將離心管轉(zhuǎn)移到 50℃放置 3.5 小時(shí)。

14.吸棄溶液 B，用 1mL TE 緩沖液常溫洗滌包埋塊 2 次，每次 15 分鐘。

15.吸棄 TE 緩沖液，用 500 uL 新鮮配制的處理液 C（50 uL 溶液 A+450 uL 超純水）常溫洗滌包埋塊 2 次，每次 15 分鐘。

16.吸棄處理液 C，用 1 mL TE 緩沖液常溫洗滌包埋塊 3 次，每次 10 分鐘.

17.吸棄 TE 緩沖液，所得包埋塊可以在 4℃保存數(shù)月待用，也可以用超純水洗滌兩次（每次 15 分鐘）后直接用做 100uL 體系甲基化 PCR 的模板。

三、對(duì)純化好的 DNA

18. 如果是純化好的 DNA，直接選用不識(shí)別 PCR 靶片段的合適內(nèi)切酶酶切純化的DNA（本試劑不提供所需試劑），總體積不超過 20uL，DNA 不超過 700 ng。

19. 酶切結(jié)束后，沸水浴 5-10 分鐘滅活內(nèi)切酶并變性 DNA。

20. 冰上放置并短暫離心數(shù)秒后，再加入 4 uL 溶液 A，50℃保溫 15 分鐘。

21. 迅速加入 50 uL 在 80℃預(yù)熱的包埋液，用手指快速?gòu)棑艄艿谆靹蛉芤翰⒗^續(xù)放80℃待用。不要吹打混勻以避免包埋液在移液槍頭中凝固。

22. 在一個(gè)新的 2 mL 離心管中，加入 1 mL 預(yù)冷的溶液 B，再加上 750 uL 石蠟油，短暫離心后將離心管放冰上預(yù)冷。

23. 迅速取 80℃保溫的混合液 10uL（第 21 步），用在空中滴加的方式加到第 22 步準(zhǔn)備的預(yù)冷離心管中，滴加的混合液遇冷將迅速在石蠟油中形成一個(gè)包埋塊。注意：不要將槍頭浸入到預(yù)冷的溶液中，否則包埋液將迅速在槍頭內(nèi)凝固。如果包埋塊沒有沉到管底，可以用槍頭將其撥到石蠟層下面的液相中。

24. 再重復(fù)上步操作 6 次（步驟 23），共可以得到 7 個(gè)包埋塊（約含 100ng DNA）。

25. 將離心管（含 7 個(gè)包埋塊）繼續(xù)放冰上 30 分鐘進(jìn)行修飾。

26. 后續(xù)操作同第 13-17 步。