酵母電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞制備液

產(chǎn)品及特點(diǎn) 本酵母電感受態(tài)細(xì)胞制備試劑是一種通過(guò)化學(xué)處理釀酒酵母和裂殖酵母電感受態(tài)細(xì)胞，使之不但馬上能用于電轉(zhuǎn)化，還能長(zhǎng)期放置后用于電轉(zhuǎn)化。它具有下列特點(diǎn)：

1. 操作簡(jiǎn)單，單溶液制備，除酵母培養(yǎng)的時(shí)間外，整個(gè)操作只需要 10 余分鐘。

2. 制備得到的感受態(tài)細(xì)胞可以-80℃保存一年，方便多次使用，免去每次轉(zhuǎn)化都要新鮮制備感受態(tài)細(xì)胞。

3. 主要用于釀酒酵母 S. cerevisia 和 S. pombe，但能否用于其他酵母（如 C.albicans、Pichia pastoris 等）不詳。

4. 高轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到 0.2-1×106 個(gè)轉(zhuǎn)化子/ug 質(zhì)粒 DNA。

5. 得到的感受態(tài)細(xì)胞可以用各種線性或環(huán)狀酵母穿梭質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)化，例如 YIp, YRp, YCp, YEp 和 YAC 等。

6. 可以用于酵母雙雜交、定點(diǎn)突變（Site－Directed Mutagenesis）、基因破壞（Gene Disruption）、等位突變基因修復(fù)（Mutant Allele Recovery）等實(shí)驗(yàn)。

7. 本試劑盒足夠處理 200 mL 酵母菌液，制備 40 管酵母感受態(tài)細(xì)胞。
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 20 次塑料袋包裝
酵母電感受態(tài)
 細(xì)胞制備液 LM81201 5 mL ×20
使用手冊(cè) LM81201sc 1 份

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸和保存，有效期一年。

使用方法 

一：電感受態(tài)細(xì)胞的制備

說(shuō)明：按本方法制備 1 管酵母電感受態(tài)細(xì)胞就需要 OD600 達(dá)到 1.0 的新鮮酵母

培養(yǎng)液 5 mL，用戶需根據(jù)制備的酵母感受態(tài)細(xì)胞數(shù)量決定培養(yǎng)細(xì)胞的體積。下

面操作只是以 10 mL 酵母為例說(shuō)明。

1. 培養(yǎng) S.pombe 細(xì)胞：挑取新鮮單菌落（4℃放置不超過(guò) 3 周的也可以），接種到 10 mL SD 液體培養(yǎng)基中。30℃搖晃培養(yǎng)，搖床速度 250rpm/分鐘，直到 OD600 達(dá)到 1.0 左右（相當(dāng)于 1×107細(xì)胞/mL）。

2. 培養(yǎng) S.cerevisiae 細(xì)胞：挑取新鮮單菌落（4℃放置不超過(guò) 3 周的也可以），接種到裝在 10 mL YPD 液體培養(yǎng)基中。30℃搖晃培養(yǎng)，搖床速度 250rpm/分鐘，直到 OD600 達(dá)到 1.0 左右（相當(dāng)于 1×107細(xì)胞/mL）。

3. 冰上放置 15 分鐘。

4. 室溫 1600rpm 離心 5 min，棄上清。

5. 用冰浴的滅菌水洗滌 3 次。

6. 用 0.2 mL 冰浴的本產(chǎn)品重懸細(xì)胞。

7. 按每管 0.1 mL 分裝到 1.5-2 mL 的冷凍管中，直接放入-80℃冰箱待用。

注意：不能放在液氮中，否則將喪失電轉(zhuǎn)化能力。

二：電轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞

1. 將裝有 0.1 mL 感受態(tài)細(xì)胞的冷凍管從冰箱取出的、放置在 30℃水浴中快速化凍（快速化凍的效果好于緩慢化凍）。

2. 用 1 mL 冰浴的本產(chǎn)品洗滌一次。

3. 加入 50 uL 冰浴的本產(chǎn)品重懸細(xì)胞。

4. 加入 1-30 ng 質(zhì)粒 DNA 并輕柔混勻。

5. 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的、距離為 0.2cm 的電擊杯中。

6. 按電擊儀的手冊(cè)設(shè)置電擊參數(shù)并進(jìn)行電擊處理，參考條件為：10kV/cm (對(duì)0.2 cm 的電擊杯，則為 2 kV), 5 ms (25 ?F, 200?)（各廠家儀器的使用略有不同，請(qǐng)嚴(yán)格按電擊儀廠家提供的手冊(cè)進(jìn)行操作）。

7. 電擊后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 1 mL 預(yù)冷的本產(chǎn)品中，輕柔混勻。

8. 取 0.2 mL 轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂盤（S.pombe 細(xì)胞需涂盤在 SD 固體培養(yǎng)基上，S.cerevisiae 細(xì)胞需涂盤在 YPD 固體培養(yǎng)基上），30℃培養(yǎng) 4-6 天。