加T試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn)某些 DNA 聚合酶具有不依賴于模板的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在只有 dTTP 存在的情況下，可以在平末端的 DNA 片段的兩個(gè) 3’端各加上一個(gè) dT 尾巴。本產(chǎn)品就是利用此原理開放的加 T 試劑盒，主要用于制備 T 載體或在平末端的 DNA 片段上加上 1 個(gè) T 尾巴。

本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：

1. 簡(jiǎn)單, 2X 加 T 預(yù)混合液中含有所需要的所有成分（包括酶）），不需要單獨(dú)準(zhǔn)備。

2. 各成分佳用量經(jīng)過優(yōu)化，用戶不需要單獨(dú)調(diào)試。

3. 適用于任何平末端的 DNA 片段，包括 Pfu DNA 聚合酶等高保真 DNA 聚合酶合成的 DNA 片段或限制性內(nèi)切酶酶切回收得到的 DNA 片段。

4. 加 T 后的載體可以作為 T 載體使用。
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 塑料袋包裝
2 X 加 T 預(yù)混液 LM60106a 1.25 mL（綠蓋）
使用手冊(cè) LM60106sc 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為一年。

自備試劑 平末端 DNA 片段、平末端質(zhì)粒 DNA、自備超純水。

使用方法 一：反應(yīng)前純化處理：

1. 平末端 DNA 片段或平末端質(zhì)粒 DNA 可以采取膠回收和酚/氯仿抽提法等常規(guī)方法純化，后溶解在水或 TE 中，終濃度以0.1 ug/uL 為宜。必須注意的是, 用 Vent, Deep Vent, Pfu,Pwo 等具有 3 到 5 外切活性的 DNA 聚合酶擴(kuò)增得到的 DNA片段，必須經(jīng)過徹底的去除殘留的酶的處理過程（如酚/氯仿抽提或 Proteinase K 處理），否則它們將在加 T 反應(yīng)時(shí)，將切除掉加上的 T 尾巴，干擾反應(yīng)。

2. 本產(chǎn)品的加尾酶在 DNA 的 3’末端的核苷酸為 T 時(shí)，加 T 效率更高，故如果有可能，好滿足此要求。

二：加 T 反應(yīng)

3. 在干凈的 0.5 mL 或 1.5 mL 離心管中，分別加入回收的 DNA20190124dx片段(0.2-2 ug)、25 uL 2 X 加 T 緩沖液、后補(bǔ)水到 50 uL，在 PCR 儀上 72℃保溫 2 小時(shí)。如果用金屬浴或水浴，必須加50uL 石蠟油，否則水分在反應(yīng)過程中將蒸發(fā)，影響加尾效率。

4. 加 T 反應(yīng)后，加尾酶將與 DNA 末端緊密結(jié)合，所以必須酚/氯仿抽提去除。如果使用 Proteinase K 處理后再用酚/氯仿抽提效果會(huì)更好。得到的 DNA 溶于適量水和 TE 中后即可用于后續(xù)連接反應(yīng)。由于加一個(gè) T 不會(huì)改變 DNA 片段的瓊脂糖電泳速度，故不能通過跑電泳檢測(cè)加尾效果。