T3體外轉(zhuǎn)錄試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn) 本試劑盒是基于沙門氏噬菌體 T3 RNA 聚合酶的 RNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，它利用含有 T3 啟動(dòng)子的模版 DNA，以 NTP 為底物，從 T3 啟動(dòng)子下游開始合成與模板 DNA 中一條鏈互補(bǔ)的 RNA，簡單快速獲得大量的 RNA 分子。本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需提供含 T3 啟動(dòng)子的 DNA 模板即可以進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄實(shí)

驗(yàn)，不需單獨(dú)準(zhǔn)備每一個(gè)成份。

2. 單溶液預(yù)配液，減少加樣次數(shù)，避免了操作誤差，增加了可重復(fù)性。

3. 模板 DNA 可以是線性化的質(zhì)粒 DNA，也可以是 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。

4. 可以合成的 RNA 的佳長度在 20 nt 到 5000 nt 之問。

5. 產(chǎn)品配方經(jīng)過精心優(yōu)化，每μg DNA 模板可以合成 2-6 μg RNA。

6. 得到的 RNA 可以用于 RNA 結(jié)構(gòu)研究、核解生物化學(xué)、體外翻譯、RNA蛋白質(zhì)相互作用、反義技術(shù)、SELEX技術(shù)和 RNA 干擾（RNAi）等實(shí)驗(yàn)。
規(guī)格及成分 成份 編號 十孔盒包裝
2×T3 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液 LM91108a 0.5 mL（本色蓋）
T3 RNA 聚合酶混合液 LM120309 50 μL（紅色蓋）
RNase-free 水 LM80403 1 mL（亮黃蓋）
使用手冊 LM91108sc 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存, 有效期一年。

自備試劑 如果需要去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的 DNA 模板，則需要 RNase-free DNase 、Tris 飽和酚、氯仿、微量核酸沉淀劑、RNase-free 75%乙醇（均可從本公司另購）

使用方法 一、制備 DNA 模板

PCR 片段和質(zhì)粒 DNA 都可以用作體外轉(zhuǎn)錄的模板，但是必須注意以下幾點(diǎn)。一是必須使用線性化的 DNA。如果是質(zhì)粒 DNA，則必須先用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切成線狀。二是需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的上游必須有 T3 啟動(dòng)子。如果模板是 PCR 產(chǎn)物，則可以在設(shè)計(jì)引物時(shí)將 T3 啟動(dòng)子序列（5’AATTAACCCTCACTAAAGG 3’）加上。如果是將 DNA 片段克隆到載體上，則需要選擇有 T3 啟動(dòng)子的載體，并且克隆位點(diǎn)必須位于 T3 啟動(dòng)子下游。三是需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的下游端好不要是 3’突出。如果是 3’突出（如選擇了 Pst I 來線性化質(zhì)粒），則好用 T4 DNA 聚合酶修平。四是必須保證 DNA一般要使用大量的 RNase A，因此質(zhì)粒 DNA 一般都有嚴(yán)重的 RNase A 污染，所以在用作模板前，好采取膠回收得方法回收質(zhì)粒 DNA。并且加入少量總 RNA 一起保溫，然后電泳檢測 RNA 是否被降解，以此判斷純化的DNA 模板是否有殘留 RNase A。

二、體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

1. 如果有 N 個(gè)樣品，強(qiáng)烈建議做一個(gè)陰性對照，故共設(shè)置 N+1 個(gè)反應(yīng)，這樣一起并排電泳時(shí)容易判斷哪個(gè)條帶是模板 DNA，哪個(gè)條帶是擴(kuò)增得到的RNA。在 N+1 個(gè) RNase-free 的塑料離心管中，在室溫下（不是在 4℃下）

按次序加入下列成分：

成分 N 個(gè)樣品管 陰性對照

DNA 模板 各 50 ng（PCR 片段模板）

或各 1μg（質(zhì)粒模板）

50 ng（PCR 片段）

1μg（質(zhì)粒 DNA）

2×T3 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液 10 μL 10 μL

T3 RNA 聚合酶混合液 1 μL 不加

RNase-free 水 補(bǔ)水到 20μL 補(bǔ)水到 20μL

注：此為 20μL 反應(yīng)體系的用量，對其他體積的反應(yīng)體系，各成分的用量可以按比例增減。如果需要標(biāo)記 RNA 探針，則需要另購 NTP 與 2×T3 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液分開提供的試劑盒。如果需要得到加帽 RNA，則需要加入自備的加帽修飾核苷酸（NEB 提供各種加帽修飾核苷酸）。

2. 37℃保溫 1-2 小時(shí)。注意：延長保溫時(shí)間并不能提高產(chǎn)量。

3. 70℃加熱 10 分鐘滅活 T3 RNA 聚合酶。

4. 取 1-3μL 電泳檢測轉(zhuǎn)錄效果。比陰性對照多出的條帶就是擴(kuò)增得到的 RNA（由于檢測時(shí)的電泳不需要堿變性膠，并且合成的 RNA 長度不一定均勻，即使長度均勻，但由于自生形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，因此不一定呈現(xiàn)清晰的電泳條帶。但由于 RNA 是單鏈，分子量比同樣長度的 DNA 小一倍，因此轉(zhuǎn)錄得到的 RNA 一般比其模板電泳速度更快。

5. 定量，可以用自備的單鏈 RNA 定量試劑盒檢測濃度，也可以肉眼比較電泳膠上 RNA 和 DNA 的強(qiáng)度。由于 RNA 是單鏈，跟核酸染料結(jié)合力低，因此同等亮度的 RNA 條帶，其 RNA 分子數(shù)一般比 DNA 的分子數(shù)多一倍。使用本試劑盒時(shí) 1μg DNA 模板一般可以合成 2-6μg 的 RNA。

6. 得到的 RNA 可以放-80℃保存（溶液中有 DNA 模板和未使用的 NTP）。

注：若需進(jìn)一步去除 T3 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中的 DNA 模板，可參考下列操作步驟，但所用試劑需另行購買，本試劑盒不提供。

1. 在體外轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入 3-5 U 自備的 RNase-free DNase。

2. 37℃保溫 15-30 分鐘。

3. 補(bǔ)水到 100 μL，

4. 用自備的等體積（100 μL）的Tris飽和酚-氯仿抽提一次去除殘留的DNase和 RNA 聚合酶。

5. 在上清中加 200 μL 自備的微量核酸沉淀劑（CAT#50903；用前需要搖晃混勻），振蕩后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘，棄上清。

6. 加入 1 mL 75%乙醇，震蕩 10 秒后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘，棄上清。

7. 短暫離心數(shù)秒，用槍頭吸棄上清。

8. 晾干半分鐘，所得沉淀即去除 DNA 模板后的 RNA?？扇苡?RNase-free水中后立即使用或放-80℃長期保存。