T7體外轉錄試劑盒

產品及特點 本試劑盒是基于 T7 RNA 聚合酶的 RNA 體外轉錄試劑盒，它利用含有 T7 啟

動子的模版 DNA，以 NTP 為底物，從 T7 啟動子下游開始合成與模版 DNA 中一條鏈互補的 RNA，簡單快速獲得大量的 RNA 分子。本產品具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需提供含 T7 啟動子的 DNA 模板即可以進行體外轉錄實驗，

不需要單獨準備每一個成份。

2. 單溶液預配液，減少加樣次數，避免了操作誤差，增加了可重復性。

3. 模版 DNA 可以是線性化的質粒 DNA，也可以是 PCR 擴增產物。

4. 可以合成的 RNA 的長度在 20nt 到 2000 nt 之間。

5. 產品配方經過精心優(yōu)化，每 ug DNA 模版可以合成 2-6 ug RNA。

6. 得到的 RNA 可以用于 RNA 結構研究、核酶生物化學、體外翻譯、RNA-蛋白

質相互作用、反義技術、SELEX 技術和 RNA 干擾（RNAi）等實驗。

7. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的體外轉錄實驗，并且只能用于科研。
規(guī)格及成分 成份 編號 十孔盒包裝
T7 轉錄預配液，2× 91106a 0.5 mL（綠色蓋）
T7 RNA 聚合酶-RI 混合液 91106c 50 μL（黃色蓋）
RNase-free 水 80403 1 mL（亮黃蓋）
使用手冊 91106sc 1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存、有效期一年。

自備試劑 Tris 飽和酚、氯仿、RNase-free 75%乙醇(均可從本公司另購) 

相關資料 一、制備 DNA 模板（本試劑盒不含所需試劑，此處信息僅供參考）

PCR 片段和質粒 DNA 都可以用作體外轉錄的模板，但是必須注意以下幾點。

一是必須使用線性化的 DNA。如果是質粒 DNA，則必須先用適當的限制性內切

酶切成線狀。

二是需要轉錄的 DNA 序列的上游必須有 T7 啟動子。如果模板是 PCR 產物，則

可以在設計引物時將 T7 啟動子序列（5’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG

3’）加上。如果是將 DNA 片段克隆到載體上，則需要選擇有 T7 啟動子的載體，

并且克隆位點必須位于 T7 啟動子下游。

三是需要轉錄的 DNA 序列的下游端不要是 3’突出。如果是 3’突出（比如

選擇了 Pst I 來線性化質粒），則用 T4 DNA 聚合酶修平。

四是必須保證 DNA 模板中沒有 RNase。由于提取質粒 DNA 的過程中一般要使

用大量的 RNase A，因此質粒 DNA 一般都有嚴重的 RNase A 污染，所以在用作

模板前，采取膠回收得方法回收質粒 DNA。并且加入少量總 RNA 一起保溫，

然后電泳檢測 RNA 是否被降解，以此來判斷純化的 DNA 模板是否有殘留 RNase

A。如果有 RNase 污染，則必須反復酚-氯仿抽提去除殘留的 RNase，然后再乙

醇沉淀質粒 DNA。

二、體外轉錄反應

1. 如果有 N 個樣品，強烈建議做一個陰性對照，故共設置 N+1 個反應，這樣一

起并排電泳時容易判斷哪個條帶是模板 DNA，哪個條帶是擴增得到的 RNA。

在 N+1 個 RNase-free 的塑料離心管中，在室溫下（不是在 4℃下）按次序

加入下列成分（T7 轉錄預配液容易產生結晶沉淀，一定要握在手中直到結晶

徹底溶解并搖勻后方可使用）：

成分 N 個樣品管 陰性對照管

DNA 模板 50 ng 左右的 PCR 片段

或 1 ug 左右的線狀質粒 不加

T7 轉錄預配液，2× 各 10 μL 10 μL

T7 RNA 聚合酶-RI 混合液 各 1 μL 1 μL

補 RNase-free 水到 20μL 20μL

注：此為 20μL 反應體系的用量，對其他反應體系，各成分的用量可以按比例

增減。本產品的 T7 轉錄預配液已經含有 NTP。如果需要標記 RNA 探針或制備

帶帽 RNA，則需要訂購 NTP 分開的試劑盒。

2. 37℃保溫 1-2 小時。注意：延長保溫時間并不能大幅提高產量。

3. 加入 2μL 自備的 500mM 的 EDTA 溶液滅活 T7 RNA 聚合酶。

4. 取 1-3 μL 電泳，此時用 DNA 模板做電泳對照。電泳時比陰性對照多出

的條帶就是擴增得到的 RNA（由于合成的 RNA 長度不均勻，即使長度均勻，

但由于自生形成發(fā)夾結構，泳動速度也不一致，所以電泳所得 RNA 條帶一般

都不是清晰，而是比較彌散的電泳條帶。但由于 RNA 是單鏈，分子量比同樣

長度的 DNA 小一倍，因此 RNA 一般比其雙鏈 DNA 模板電泳速度更快。

5. 定量，可以用自備的單鏈 RNA 定量試劑盒檢測濃度。不推薦使用電泳定量。

使用本試劑盒時 1μg DNA 模板一般可以合成 2-6μg 的 RNA。

6. 得到的 RNA 可以放-80℃保存。如需去除 DNA 模板，請按下面步驟操作。

三、去除 DNA 模板（所需試劑需要另購）

7. 在 20μL 體積的體外轉錄體系中加入 2μL 的 10×DNase Buffer 和 1 μL 自

備的 RNase-free DNase（3-5 U/μL）。

8. 37℃保溫 30 分鐘。

9. 補 RNase-free 水到 100 μL。增加體積可以減少樣品的丟失。

10. 用自備的等體積（100 μL）的 Tris 飽和酚-氯仿，震蕩混勻后 14000g 離心

3 分鐘，將上清轉移到新的離心管中。此步去除 DNase 和 RNA 聚合酶。

11. 加自備的 200 μL 無水乙醇和 10μL 3M 的乙酸鈉溶液（pH5.2），振蕩后14000 rpm 離心 20 分鐘，RNA 形成沉淀，棄上清。

12. 在沉淀中加入 1 mL 75%乙醇，震蕩 10 秒后 14000g 離心 5 分鐘，棄上清。

13. 短暫離心數秒，用槍頭吸棄上清。不要丟失沉淀。

14. 晾干，所得沉淀即體外轉錄所得的 RNA。