絲狀真菌線粒體DNAout

產(chǎn)品及特點(diǎn) 線粒體是重要的、負(fù)責(zé)能量產(chǎn)生的極其重要的細(xì)胞器。對絲狀真菌線粒體進(jìn)行生化，遺傳和分子生物學(xué)研究都需要先進(jìn)行線粒體純化。本產(chǎn)品就是基于密度梯度離心的，專門用于從絲狀真菌葉片中純化完整線粒體、再從中純化線粒體 DNA 的試劑盒。

它具有下列特點(diǎn)：

1. 即用型試劑盒，用戶不需要單獨(dú)配制各種溶液。

2. 所得線粒體可用于后續(xù)的 SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白組分析、線粒體 DNA 和線粒體 RNA 純化。

3. 本產(chǎn)品足夠 15 次線粒體純化和 15 次線粒體 DNA 提取，每次可處理 10-20g 菌絲體，能得到 1-5 mg 左右線粒體。

4. 已經(jīng)成功用于 Aspergillus candidus、Aspergillus nidulans、Magnaportheoryzae 、 Neurospora crassa 、 Penicillium chrysogenum 、 Rhizopusstononifer 等絲狀真菌。 
規(guī)格及成分 成 份 編 號 15 次大盒包裝 
絲狀真菌線粒體 DNAout 溶液 A 130831a 250 mL×2 絲狀真菌線粒體 DNAout 成分 B 130831b 150 g(干粉) 絲狀真菌線粒體 DNAout 溶液 C 130831c 120 mL 帶柄尼龍濾膜 130831d 1 個(gè) 通用線粒體 DNAout 溶液 A 130831e 10 mL 通用線粒體 DNAout 溶液 B 130831f 5 mL 使用手冊 130831sc 1 份

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸和保存, 保存期限一年。

自備試劑 去離子水、氯仿、異丙醇、75%乙醇、TE。

使用方法 

注意：純化 DNA 提取用的線粒體的要求比純化功能研究用的線粒體的要求要低，但整個(gè)操作還是在冰上或者在冷室進(jìn)行，所用器皿和溶液在 4℃預(yù)冷，離心要在 4℃進(jìn)行，離心力以 g 而不是 rpm 計(jì)算。

一：菌絲的搖瓶培養(yǎng)

1. 使用合適的絲狀真菌培養(yǎng)基，接種孢子至終濃度為 2×10E6/mL。一般 100 mL液體培養(yǎng)基可以得到 0.8-1.2g 菌絲體，而本方法一次可以處理 10-20g 菌絲體，故一次培養(yǎng) 1-2 升。

2. 在合適的溫度（如 25℃、30℃或 37℃，根據(jù)真菌不同而不同）250rpm/min搖晃培養(yǎng) 16-20 小時(shí)。

3. 用多層紗布或多層過濾紙過濾收集菌絲，用冰浴的自備去離子水洗滌菌絲三次去除殘留的培養(yǎng)基。

4. 用吸水紙吸干菌絲的水分，稱重后立即使用。如果在-80℃或液氮長期放置，線粒體回收效率將減低。

二：線粒體粗提液的制備

5. 制備溶液 A 工作液：每次提取需 150mL 溶液 A 工作液，制備方法是將 20mL溶液 A 和 130mL 自備去離子水混合，冰上預(yù)冷即可。

6. 在 200mL 燒杯中，加入 100mL 預(yù)冷的溶液 A 工作液，再加入新制備的菌絲體，然后全部轉(zhuǎn)移到 Waring 勻漿機(jī)（家用果汁勻漿機(jī)）中，低速勻漿 10 秒，避免起泡沫。用玻璃棒把菌絲按入勻漿機(jī)底部后，再低速勻漿 10 秒。注意：還可以選擇 Dounce 玻璃勻漿器，Polytron 勻漿機(jī)和研磨（加玻璃珠）等方法，但它們單次處理量一般都較小，需多份處理再匯集。

7. 用帶柄尼龍濾膜過濾勻漿液，用預(yù)冷的 200 mL 量筒收集穿透液。

8. 將剩下的菌絲體轉(zhuǎn)移到 Waring 勻漿機(jī)中，再加入 40 mL 預(yù)冷的溶液 A 工作液，低速勻漿 10 秒，用上步的帶柄尼龍濾膜過濾，用預(yù)冷的 200 mL 量筒收集穿透液。注意：帶柄尼龍濾膜后可反復(fù)使用。

9. 將穿透液分到 4 個(gè)預(yù)冷的 50 mL 的塑料離心管中（每個(gè)約 35 mL）。

10. 在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 4000 g 離心 10 分鐘，小心轉(zhuǎn)移上清（含線粒體的部分）到 4 個(gè)新的離心管中。沉淀含細(xì)胞核和未裂解的細(xì)胞，可以棄之不用。如果要用于純化細(xì)胞核 DNA，則可以放-80℃長期保留。

11. 將含上清液的 4 個(gè)離心管在 4℃ 10000 g 離心 20 分鐘。

12. 每個(gè)離心管中加 2.5mL 預(yù)冷的溶液 A 工作液重懸線粒體沉淀并匯集（共約 10mL），此為線粒體粗提液。

13. 如果直接用線粒體粗提液提取線粒體 DNA，容易有細(xì)胞核 DNA 污染。具體步驟是：在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 10000 g 離心 7 分鐘，小心棄上清，沉淀為線粒體，直接用于第三步的線粒體 DNA 提取。

14. 如果需要高純度、無污染的線粒體 DNA，則需要用密度梯度離心法將完整的線粒體和其他細(xì)胞碎片進(jìn)一步分離。具體見下步線粒體精提液的制備。

三：線粒體精提液的制備（密度梯度離心法）

15. 制備重液和輕液：將 4.1 克成分 B 干粉加到 6.3 mL 溶液 C 中，充分搖晃混勻得 10 mL 重液。將 4.1 克成分 B 干粉加到 6.3 mL 去離子水中，充分搖晃混勻得 10mL 輕液。

16. 在 50 mL 塑料離心管中先加入 10 mL 重液，再在其上輕輕加上 10 mL 輕液，最后加上第 11 步所得的約 10 mL 線粒體粗提液。

17. 加平衡離心管后在水平轉(zhuǎn)子冷凍超速離心機(jī)上 4℃ 43000 g 離心 2 小時(shí)，重液和輕液間的帶為完整線粒體。

18. 用廣口吸管小心將線粒體轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入等倍體積的預(yù)冷的溶液 C，輕柔混勻。取少量在相差顯微鏡下檢查線粒體完整性。

19. 在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 19000 g 離心 20 分鐘，小心將上清吸出后，線粒體沉淀可以直接用于 DNA 提取。

四：線粒體 DNA 提取

20. 將 600 uL 通用線粒體 DNAout 溶液 A 加入到上步得到的線粒體沉淀中并吹打混勻，然后轉(zhuǎn)移到 1.5 mL 離心管中。

21. 65℃放置 5 分鐘。

22. 加入 300 uL 通用線粒體 DNAout 溶液 B，震蕩混勻 10-30 秒。注意：溶液 B非常粘稠，可以將其預(yù)熱到 65℃并剪掉一截槍頭后再取。

23. 加入 200 uL 自備的氯仿，震蕩混勻 10-30 秒。

24. 12,000 g 室溫離心 3 分鐘。此時(shí)上清液將變得透明，中間層有白膜。

25. 小心轉(zhuǎn)移上清液（約 0.8 mL）到一個(gè)新的 1.5 mL 離心管中，避免觸及中間層的白膜，可留少量上清不取。

26. 加入 1 倍體積的自備異丙醇，顛倒 30 次混勻。

27. 12,000 g 室溫離心 5 分鐘，小心棄上清液。

28. 在離心管中加入 1 mL 自備的 75%乙醇，震蕩 30 秒。

29. 12,000 g 室溫離心 1 分鐘，小心棄上清液。

30. 12,000 g 室溫離心半分鐘，殘留液體將匯集在管底。

31. 用洗液槍吸棄管底殘留液（約 50 uL）。

32. 加 50-100 uL 自備的 TE 緩沖液，溶解 DNA 沉淀即得線粒體 DNA 溶液。直接取 5-10 uL 電泳檢測，其余放直接使用或放-80℃冰箱備用。