一、項(xiàng)目闡述
近年來(lái)，由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)開(kāi)發(fā)的同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技術(shù)是一種新的、功能強(qiáng)大的可同時(shí)對(duì)四種樣品進(jìn)行絕對(duì)和相對(duì)定量研究的方法。
iTRAQ試劑為可與氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈連接的胺標(biāo)記同重元素(isobaric)。在質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標(biāo)記的不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。而在串聯(lián)質(zhì)譜中，信號(hào)離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比(114～117)的峰，因此，根據(jù)波峰的高度及面積，可以得到蛋白質(zhì)的定量信息。
iTRAQ試劑為可與氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈連接的胺標(biāo)記同重元素(isobaric)。在質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標(biāo)記的不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。而在串聯(lián)質(zhì)譜中，信號(hào)離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比(114～117)的峰，因此，根據(jù)波峰的高度及面積，可以得到蛋白質(zhì)的定量信息。
雖然DIGE和ICAT已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)研究，但是iTRAQ作為一種新的蛋白質(zhì)絕對(duì)和相對(duì)定量技術(shù)，具有很好的精確性和重復(fù)性，并且彌補(bǔ)了DIGE及ICAT的不足。
分析目標(biāo)
尋找差異表達(dá)蛋白，并分析蛋白功能；
二、項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)方案
?iTRAQ作為近年來(lái)開(kāi)發(fā)的一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究技術(shù)，結(jié)合非凝膠串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)復(fù)雜樣本、細(xì)胞器、細(xì)胞裂解液等樣本進(jìn)行相對(duì)定量研究。
1、樣本還原、變性、半胱氨酸封閉；
2、胰蛋白酶消化蛋白；
3、消化蛋白的iTRAQ試劑標(biāo)記；
4、混合標(biāo)記蛋白到同一個(gè)試管內(nèi)；
5、LC-MS/MS質(zhì)譜檢測(cè)及分析；
三、項(xiàng)目分析方案
差異基因篩選
我們利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法篩選差異表達(dá)的蛋白。一般認(rèn)為高豐度蛋白鑒定出多個(gè)肽段，低豐度蛋白鑒定出較少肽段，因此檢定出來(lái)的肽段數(shù)可以直接反映蛋白的表達(dá)量。我們認(rèn)為經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)校正的p-value: p<0.01的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因。
?GO數(shù)據(jù)庫(kù)包含了基因參與的生物過(guò)程，所處的細(xì)胞位置，發(fā)揮的分子功能三方面功能信息，并將概念粗細(xì)不同的功能概念組織成DAG（有向無(wú)環(huán)圖）的結(jié)構(gòu)。Gene Ontology是一個(gè)使用有控制的詞匯表和嚴(yán)格定義的概念關(guān)系，以有向無(wú)環(huán)圖的形式統(tǒng)一表示各物種的基因功能分類(lèi)體系，從而較全面地概括了基因的功能信息，糾正了傳統(tǒng)功能分類(lèi)體系中常見(jiàn)的維度混淆問(wèn)題。在基因表達(dá)譜分析中，GO常用于提供基因功能分類(lèi)標(biāo)簽和基因功能研究的背景知識(shí)。利用GO的知識(shí)體系和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，旨在發(fā)掘與基因差異表達(dá)現(xiàn)象關(guān)聯(lián)的單個(gè)特征基因功能類(lèi)或多個(gè)特征功能類(lèi)的組合。
?對(duì)于每一種表達(dá)趨勢(shì)的基因，選擇性的進(jìn)gene ontology功能分析。對(duì)差異表達(dá)的所有基因向gene ontology數(shù)據(jù)庫(kù)的各節(jié)點(diǎn)映射。計(jì)算每個(gè)節(jié)點(diǎn)的基因數(shù)目，并結(jié)合整個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的基因作為背景分部，對(duì)于每個(gè)節(jié)點(diǎn)，得到一個(gè)2x2的表格，使用超幾何分布檢驗(yàn)基因在每個(gè)GO節(jié)點(diǎn)的富集或貧乏程度。
差異蛋白/基因之間相互網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。
找出差異表達(dá)基因在生物學(xué)通路中的位置，以闡明其生物學(xué)功能以及不同基因之間的相互作用。
1）、把差異表達(dá)基因定位在生物學(xué)通路（Pathway）上。
2）、統(tǒng)計(jì)分析，確定差異基因可否可以代表某些生物學(xué)通路
分析方法：
我們將差異基因使用GenMAPP v2.1向KEGG pathway數(shù)據(jù)庫(kù)映射，并統(tǒng)計(jì)基因在每個(gè)pathway中的富集程度（enrichment p-value）。
分析結(jié)果：
共找到n個(gè)相關(guān)的pathway（其中4個(gè)pathway p-value<0.05）
轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)分析
利用相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（TF）數(shù)據(jù)庫(kù)，將差異基因的啟動(dòng)子(基因個(gè)外顯子上游1000bp)提取出來(lái)。我們使用HsPD 提供的啟動(dòng)子序列。轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)使用TRANSFAC 7.0 public。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)使用pwmatch 程序，對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子分析其在上調(diào)基因和下調(diào)基因的分布情況，利用chi-square test 尋找有差異的轉(zhuǎn)錄因子。
與傳統(tǒng)雙向電泳定量分析相比，iTRAQ具有以下技術(shù)優(yōu)勢(shì)
??? 1、靈敏度高，檢測(cè)限低，可檢測(cè)出低豐度蛋白；
??? 2、分離能力強(qiáng),分析范圍廣,iTRAQ可以對(duì)任何類(lèi)型的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，包括高分子量蛋白質(zhì)、酸性蛋白和堿性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白；
?? 3、 高通量：同時(shí)對(duì)8個(gè)樣本進(jìn)行分析，提高了實(shí)驗(yàn)通量，可同時(shí)對(duì)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)或不同處理的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析；?
?? 4、結(jié)果可靠：定性與定量分析結(jié)果更加可靠；
?? 5、自動(dòng)化程度高：液相與質(zhì)譜連用，自動(dòng)化操作，分析速度快，分離效果好。
iTRAQ技術(shù)服務(wù)內(nèi)容
?? 1、樣本制備與定量；iTRAQ試劑標(biāo)記；
?? 2、液相分離和質(zhì)譜分析；數(shù)據(jù)庫(kù)檢索；
?? 3、蛋白質(zhì)定量分析；
?? 4、相關(guān)生物信息分析；
?? 5、實(shí)驗(yàn)報(bào)告提交。
iTRAQ實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容
?? 1、蛋白定鑒定和定量分析結(jié)果；
?? 2、顧客指定蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰圖；
?? 3、實(shí)驗(yàn)完整的實(shí)驗(yàn)步驟、使用儀器、軟件檢索參數(shù)等
?