一、項目闡述
近年來，由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)開發(fā)的同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技術(shù)是一種新的、功能強大的可同時對四種樣品進行絕對和相對定量研究的方法。
iTRAQ試劑為可與氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈連接的胺標記同重元素(isobaric)。在質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標記的不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。而在串聯(lián)質(zhì)譜中，信號離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比(114～117)的峰，因此，根據(jù)波峰的高度及面積，可以得到蛋白質(zhì)的定量信息。
iTRAQ試劑為可與氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈連接的胺標記同重元素(isobaric)。在質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標記的不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。而在串聯(lián)質(zhì)譜中，信號離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比(114～117)的峰，因此，根據(jù)波峰的高度及面積，可以得到蛋白質(zhì)的定量信息。
雖然DIGE和ICAT已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)研究，但是iTRAQ作為一種新的蛋白質(zhì)絕對和相對定量技術(shù)，具有很好的精確性和重復(fù)性，并且彌補了DIGE及ICAT的不足。
分析目標
尋找差異表達蛋白，并分析蛋白功能；
二、項目實驗方案
?iTRAQ作為近年來開發(fā)的一種新的蛋白質(zhì)組學定量研究技術(shù)，結(jié)合非凝膠串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對復(fù)雜樣本、細胞器、細胞裂解液等樣本進行相對定量研究。
1、樣本還原、變性、半胱氨酸封閉；
2、胰蛋白酶消化蛋白；
3、消化蛋白的iTRAQ試劑標記；
4、混合標記蛋白到同一個試管內(nèi)；
5、LC-MS/MS質(zhì)譜檢測及分析；
三、項目分析方案
差異基因篩選
我們利用統(tǒng)計學方法篩選差異表達的蛋白。一般認為高豐度蛋白鑒定出多個肽段，低豐度蛋白鑒定出較少肽段，因此檢定出來的肽段數(shù)可以直接反映蛋白的表達量。我們認為經(jīng)過檢驗校正的p-value: p<0.01的基因為差異表達基因。
?GO數(shù)據(jù)庫包含了基因參與的生物過程，所處的細胞位置，發(fā)揮的分子功能三方面功能信息，并將概念粗細不同的功能概念組織成DAG（有向無環(huán)圖）的結(jié)構(gòu)。Gene Ontology是一個使用有控制的詞匯表和嚴格定義的概念關(guān)系，以有向無環(huán)圖的形式統(tǒng)一表示各物種的基因功能分類體系，從而較全面地概括了基因的功能信息，糾正了傳統(tǒng)功能分類體系中常見的維度混淆問題。在基因表達譜分析中，GO常用于提供基因功能分類標簽和基因功能研究的背景知識。利用GO的知識體系和結(jié)構(gòu)特點，旨在發(fā)掘與基因差異表達現(xiàn)象關(guān)聯(lián)的單個特征基因功能類或多個特征功能類的組合。
?對于每一種表達趨勢的基因，選擇性的進gene ontology功能分析。對差異表達的所有基因向gene ontology數(shù)據(jù)庫的各節(jié)點映射。計算每個節(jié)點的基因數(shù)目，并結(jié)合整個數(shù)據(jù)庫的基因作為背景分部，對于每個節(jié)點，得到一個2x2的表格，使用超幾何分布檢驗基因在每個GO節(jié)點的富集或貧乏程度。
差異蛋白/基因之間相互網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。
找出差異表達基因在生物學通路中的位置，以闡明其生物學功能以及不同基因之間的相互作用。
1）、把差異表達基因定位在生物學通路（Pathway）上。
2）、統(tǒng)計分析，確定差異基因可否可以代表某些生物學通路
分析方法：
我們將差異基因使用GenMAPP v2.1向KEGG pathway數(shù)據(jù)庫映射，并統(tǒng)計基因在每個pathway中的富集程度（enrichment p-value）。
分析結(jié)果：
共找到n個相關(guān)的pathway（其中4個pathway p-value<0.05）
轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測分析
利用相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（TF）數(shù)據(jù)庫，將差異基因的啟動子(基因個外顯子上游1000bp)提取出來。我們使用HsPD 提供的啟動子序列。轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫使用TRANSFAC 7.0 public。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測使用pwmatch 程序，對每個轉(zhuǎn)錄因子分析其在上調(diào)基因和下調(diào)基因的分布情況，利用chi-square test 尋找有差異的轉(zhuǎn)錄因子。
與傳統(tǒng)雙向電泳定量分析相比，iTRAQ具有以下技術(shù)優(yōu)勢
??? 1、靈敏度高，檢測限低，可檢測出低豐度蛋白；
??? 2、分離能力強,分析范圍廣,iTRAQ可以對任何類型的蛋白質(zhì)進行鑒定，包括高分子量蛋白質(zhì)、酸性蛋白和堿性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白；
?? 3、 高通量：同時對8個樣本進行分析，提高了實驗通量，可同時對多個時間點或不同處理的蛋白質(zhì)進行分析；?
?? 4、結(jié)果可靠：定性與定量分析結(jié)果更加可靠；
?? 5、自動化程度高：液相與質(zhì)譜連用，自動化操作，分析速度快，分離效果好。
iTRAQ技術(shù)服務(wù)內(nèi)容
?? 1、樣本制備與定量；iTRAQ試劑標記；
?? 2、液相分離和質(zhì)譜分析；數(shù)據(jù)庫檢索；
?? 3、蛋白質(zhì)定量分析；
?? 4、相關(guān)生物信息分析；
?? 5、實驗報告提交。
iTRAQ實驗報告內(nèi)容
?? 1、蛋白定鑒定和定量分析結(jié)果；
?? 2、顧客指定蛋白質(zhì)對應(yīng)的質(zhì)譜峰圖；
?? 3、實驗完整的實驗步驟、使用儀器、軟件檢索參數(shù)等
?