Monoclonal Anti-cAMP Antibody Based
Direct cAMP ELISA Kit
(New Non-acetylated Version)
Catalog No. 80203
96 Well Kit
產(chǎn)品介紹
環(huán)磷酸腺苷 (腺苷-3’，5’-環(huán)化一磷酸，cAMP)能調(diào)節(jié)各種生理功能，如生物學(xué)心血管功能、 學(xué)習(xí)和記憶、 嗅覺、 免疫反應(yīng)、哮喘及腎功能(1,2)。cAMP是磷酸二酯酶刺激激活腺苷酸環(huán)化酶催化ATP環(huán)化形成的，激活或抑制磷酸二酯酶能使cAMP的濃度提高。激活受體的腺苷酸環(huán)化酶的阻斷劑和cAMP的特定磷酸二酯酶的抑制劑，廣泛用于人類疾病。例如，阻斷cAMP的運(yùn)行，使得β-類腎上腺激素受體增加而用于治療心率不齊、高血壓、心肌埂塞和心力衰竭。針對(duì)cAMP的特定Ⅱ型和Ⅳ 型腺苷酸環(huán)化酶的抑制劑，正在進(jìn)行增強(qiáng)認(rèn)知方面的臨床測(cè)試。因此為篩選出腺苷酸環(huán)化酶激活劑或磷酸二酯酶抑制劑，需要一個(gè)高敏感度、特異性的、可重復(fù)的方案用于檢測(cè) cAMP的濃度。
目前商業(yè)化提供的一些cAMP檢測(cè)試劑盒主要應(yīng)用ELISA的方案，使用的是非親和純化的cAMP多克隆抗體，盡管具有靈敏性，這些多克隆抗體與ATP存在一定程度的交叉反應(yīng)?；贏TP是cAMP生產(chǎn)的底物，很有必要找到一種能高特異性識(shí)別cAMP的抗體。
紐斯特生物開發(fā)出了唯一的鼠單克隆抗體的cAMP ELISA 檢測(cè)試劑盒。該單克隆抗體對(duì)cAMP的特異性比cAMP、ATP等類似的小分子高出108 倍以上。相較于其他的多克隆抗體cAMP試劑盒，紐斯特生物cAMP ELISA試劑盒能顯著的提高其靈敏性和特異性，且能有效避免來自動(dòng)物多克隆抗體的批次間差異， 因此可以提供長(zhǎng)久有效地可重復(fù)性定量檢測(cè)。
此外，其他ELISA試劑盒的多克隆抗cAMP抗體與乙?；痗AMP的親和力明顯高于非乙酰化cAMP，本試劑盒的單克隆cAMP抗體與乙?；蚍且阴；痗AMP具有同樣的親和力 。因此，紐斯特生物cAMP ELISA試劑盒中的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品不需要乙?；幚?，從而明顯縮短了分析時(shí)間，有效避免了乙?；^程中的有機(jī)試劑的使用，為大家提供了一個(gè)更安全、更健康的工作環(huán)境。
實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒利用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法來測(cè)定細(xì)胞提取物或體外腺苷酸環(huán)化酶實(shí)驗(yàn)中的cAMP的水平。簡(jiǎn)而言之，將羊抗鼠多克隆抗體包被在酶標(biāo)板上，細(xì)胞提取物或體外腺苷酸環(huán)化酶實(shí)驗(yàn)中的cAMP與固定數(shù)量的偶聯(lián)辣根過氧化物酶的cAMP或堿性磷酸酶競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合抗cAMP單克隆抗體，已知的cAMP作為標(biāo)準(zhǔn)品來做標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)過一段時(shí)間孵育，洗掉所有試劑，加入底物進(jìn)行顯色。將多孔板置于酶標(biāo)儀上，于450nm或405nm波長(zhǎng)下，進(jìn)行讀數(shù)。黃色的光強(qiáng)度與樣品中cAMP的濃度呈反比關(guān)系?；赾AMP標(biāo)準(zhǔn)品所得曲線，通過測(cè)得的光密度可以計(jì)算出樣品中cAMP的濃度。
研究背景
cAMP作為獨(dú)特的第二信使，可調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)各種外源和內(nèi)源信號(hào)分子的反應(yīng)。 它主要通過激活蛋白激酶、控制特定的離子通道、磷酸二酯酶調(diào)節(jié)細(xì)胞環(huán)核苷酸濃度以及激活Epac(通過cAMP直接激活蛋白交換)(3-6)來調(diào)節(jié)生理過程。通過腺苷酸環(huán)化酶可以實(shí)現(xiàn)ATP轉(zhuǎn)化為cAMP。 哺乳動(dòng)物體內(nèi)的主要腺苷酸環(huán)化酶家族均是橫跨膜的，具有9個(gè)亞型，且可通過G蛋白Gs或鈣離子/鈣調(diào)素(1)激活。另外，還有一種可溶性的腺苷酸環(huán)化酶，可以通過碳酸鹽或Ca2 +調(diào)節(jié)(7)。
試劑盒組成材料和試劑
1. 羊抗小鼠IgG包被的96孔微孔板一張 catalog No.30101
該微孔板將特異性識(shí)別小鼠IgG 的山羊抗體包被于可拆分酶標(biāo)條上。
2. cAMP偶聯(lián)的辣根過氧化物酶工作液6 mL catalog No. 30102
本包裝含1000×偶聯(lián)酶儲(chǔ)存液和稀釋緩沖液。
3. 抗cAMP的小鼠單克隆抗體工作液6 mL catalog No. 26002-2
本包裝含1000×抗體儲(chǔ)存液和稀釋緩沖液。
注意：為了穩(wěn)定和長(zhǎng)效的實(shí)驗(yàn)，抗體儲(chǔ)存于-80℃。在使用前將6μL 1000×偶聯(lián)酶儲(chǔ)存液加入到6 mL 稀釋緩沖液中配制為工作液，并輕輕混勻。工作液請(qǐng)避免反復(fù)凍融。
4. 中和液6 mL catalog No. 30103
5. 10×濃縮洗滌液15 mL catalog No. 30103
含去污劑的磷酸鹽緩沖液。
6. cAMP標(biāo)準(zhǔn)品0.25 mL catalog No. 30203
濃度5000 pmol/ mL
7. 顯色底物A，12 mL catalog No. 30107
8. 顯色底物B, 12 mL。 catalog No. 30108
9. 終止液，6 mL； catalog No. 30110
注意：該溶液有腐蝕性；儲(chǔ)存時(shí)請(qǐng)旋緊瓶蓋
試劑盒儲(chǔ)存要求
本試劑盒所有組分在有效期限內(nèi)，于4℃穩(wěn)定保存。為了長(zhǎng)效的實(shí)驗(yàn)，1000×儲(chǔ)液請(qǐng)保存于-80℃。本試劑盒未提供的必需試劑
1. 去離子水或蒸餾水。
2. 濃鹽酸。
3. 量程在5μL至1000μL之間的精密移液管。
4. 量程為50μL和200μL的中繼移液器。
5. 用于稀釋儲(chǔ)液的一次性燒杯。
6. 刻度量筒。
7. 微孔板振蕩器。
8. 吸水紙。
9. 酶標(biāo)儀，可讀波長(zhǎng)450nm，在570nm至590nm之間應(yīng)有修正。
樣品處理
紐斯特生物的ELISA試劑盒適用于檢測(cè)經(jīng)過鹽酸處理而終止內(nèi)源性磷酸二酯酶活性的cAMP樣品。這種樣品可直接應(yīng)用于檢測(cè)，而不需要蒸發(fā)和進(jìn)一步的處理。
組織樣本需預(yù)先冰凍于液氮中。在不銹鋼研缽中用液氮將組子樣本研磨成精細(xì)粉末。待液氮揮發(fā)完后，稱量冰凍組織樣本并加入10倍體積的0.1M HCl混勻。室溫以大于600g離心力離心，取上層清夜用0.1M HCl稀釋至適當(dāng)濃度。
對(duì)于生長(zhǎng)的組織培養(yǎng)液中的細(xì)胞，首先移除培養(yǎng)基，然后加入0.1M HCl處理細(xì)胞。孵育10分鐘并觀察細(xì)胞是否被裂解；如果裂解不充分，接著孵育10分鐘并觀察。以大于600g離心力于室溫離心，收集上清直接用于實(shí)驗(yàn)。臨用前在0.1M HCl中加入0.1%至1%濃度的Triton-x 100可增強(qiáng)細(xì)胞和組織裂解。在這個(gè)濃度范圍內(nèi)，去污劑并不干擾試驗(yàn)的結(jié)合部位，但是會(huì)適度的增加光密度值。含有Triton的樣品需利用標(biāo)準(zhǔn)曲線估計(jì)濃度，為了最精確的測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線需以相同方式稀釋。取1 mL細(xì)胞培養(yǎng)上清加入10μL濃鹽酸，600g離心力于室溫離心，上清液直接用于實(shí)驗(yàn)測(cè)定分析。
注意步驟
1. 在使用前，將所有試劑放置30分鐘，平衡至室溫。
2. 用試劑預(yù)先潤(rùn)洗槍頭在使用；取各種樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和試劑必需更換槍頭。
3. 移取標(biāo)準(zhǔn)品和樣品到微孔底部。
4. 從微孔的邊緣加入試劑，以避免污染。
5. 本試劑盒使用可拆分的微孔酶標(biāo)條，使用者可根據(jù)樣品量多少進(jìn)行拆分。未使用的酶標(biāo)條保持干燥，密封于試劑盒提供的鋁封袋中，于4℃保存。微孔酶標(biāo)條需安裝在相應(yīng)的框架上使用。
6. 在加入顯色底物前，確保微孔內(nèi)沒有殘留的洗滌液。微量殘留的洗滌液可能導(dǎo)致分析結(jié)果的變化。
試劑準(zhǔn)備
1. 非乙?；痗AMP標(biāo)準(zhǔn)品
將5000 pmol/mL cAMP標(biāo)準(zhǔn)品溶液平衡至室溫。從#1至#6標(biāo)記六只潔凈試管。移取475μL 0.1M HCl到#1號(hào)試管，400μL到#2至#6號(hào)試管。加入25μL 5000 pmol/mL cAMP標(biāo)準(zhǔn)品到#1管中，劇烈渦旋震蕩。從#1管中取出100μL溶液至#2管中，渦旋震蕩。以此類推，重復(fù)上步操作，梯度稀釋至#6管。
經(jīng)以上操作，#1至#6管中cAMP標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為250,50，10,2,0.4和0.08 pmol/mL（詳見cAMP實(shí)驗(yàn)稀釋詳情鍵盤紙）。稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品需在30分鐘內(nèi)使用。
標(biāo)記一只試管作為無標(biāo)準(zhǔn)品空白對(duì)照（NSB）。移取600μL 0.1M HCl到NSB管中。
2. 洗滌液
將15 mL 10×洗滌液儲(chǔ)液加到135 mL去離子水中，稀釋成工作液。稀釋液可在室溫保存至試劑盒有效期限，或者3個(gè)月。
實(shí)驗(yàn)步驟
使用前將各種試劑取出放置30分鐘，平衡至室溫。所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必需設(shè)置平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
快速加入試劑至樣品中，立即漩渦震蕩2秒混勻。
1. 依據(jù)實(shí)驗(yàn)鍵盤紙決定酶標(biāo)條的使用量，將剩余的酶標(biāo)條連同干燥劑一起放回密封塑料袋，密封，4℃保存。
2. 移取50μL中和液至各個(gè)微孔中，除了TA(全活性)孔和Blank(空白)孔。
3. 移取100μL 0.1M HCl至NSB(非特異結(jié)合)孔和B0孔(0 pmol/mL cAMP標(biāo)準(zhǔn)品)。
4. 移取100μL cAMP標(biāo)準(zhǔn)品至相應(yīng)的孔。
5. 移取100μL樣品至相應(yīng)的孔。
6. 移取50μL 0.1M HCl至NSB(非特異結(jié)合)孔。
7. 移取50μL 偶聯(lián)酶至各孔中，除了TA(全活性)孔和Blank(空白)孔。
8. 移取50μL 抗體工作液至各孔中，除了TA(全活性)孔、Blank(空白)孔和NSB(非特異結(jié)合)孔。
9. 將酶標(biāo)孔置于孔板振動(dòng)器上，250~500rpm，室溫孵育2小時(shí)。
10. 在吸水紙上拍干微孔內(nèi)溶液，加洗滌液400μL每孔洗3次，每次需拍干。
11. 最后一次洗滌，清空各微孔，在干凈的無塵吸水紙上輕巧酶標(biāo)板數(shù)次，以確保沒有洗滌液殘留。
12. 加5μL 偶聯(lián)酶至TA(全活性)孔。
13. 每孔200μL顯色底物溶液，于室溫靜置5~30分鐘。（顯色底物A和B需在臨用前15分鐘內(nèi)等體積混合，并避光放置。）
14. 每孔加入50μL終止液。終止后立即讀數(shù)。
15. 清除酶標(biāo)儀Blank(空白)孔值，讀取450nm處的光密度值，在570nm至590nm之間有修正。如果酶標(biāo)儀不能自動(dòng)清除Blank(空白)孔值，那么手動(dòng)扣除每個(gè)讀數(shù)的Blank(空白)孔光密度值。
結(jié)果計(jì)算
樣品中cAMP濃度有多種計(jì)算方法。X軸表示cAMP標(biāo)準(zhǔn)品濃度，Y軸表示凈光密度的平均值或者百分比值。
1 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的凈光密度(OD)平均值的計(jì)算：
凈OD平均值 = OD平均值 － NSB孔OD平均值
2 計(jì)算不同梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)合率占結(jié)合率(B0孔)的百分比，計(jì)算公式 如下：
百分比值 = (凈OD平均值/ B0孔OD平均值)×100
3 繪制凈OD平均值或百分比值對(duì)cAMP標(biāo)準(zhǔn)品濃度的Logit-Log曲線。通過插值即可得到樣品中cAMP濃度。
標(biāo)準(zhǔn)曲線
下面的曲線不能用于計(jì)算cAMP濃度。每次實(shí)驗(yàn)需新做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。
靈敏度
通過比較10個(gè)B0孔平均光密度值(OD)和10個(gè)5號(hào)管標(biāo)準(zhǔn)品的平均光密度值，計(jì)算出靈敏度。cAMP濃度的檢測(cè)極限通過標(biāo)準(zhǔn)曲線上0位置的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差來測(cè)定。
OD(B0平均數(shù)) =0.685± 0.003
OD（5號(hào) 標(biāo)準(zhǔn)品平均數(shù)）=0.604± 0.010
光密度偏差(0-0.4 pmol/mL) =0.081
2 SD's of the Zero Standard =0.006
靈敏度 =081.0006.0/0.8×0.4 pmol/mL =29.6 fmol/mL
線性關(guān)系
cAMP濃度為16.0pmol/mL的樣品，用0.1M HCl進(jìn)行連續(xù)七次1:2梯度稀釋。將實(shí)際的cAMP濃度和測(cè)定的cAMP濃度繪制圖表。該直線的斜率為1.000，相關(guān)系數(shù)為0.999。
交叉反應(yīng)
部分相關(guān)化合物的交叉反應(yīng)由競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定。將可能的交叉反應(yīng)物溶解到試劑盒分析緩沖液中，濃度從500pmol/mL至500,000pmol/mL。這些樣品通過乙?；赾AMP競(jìng)爭(zhēng)分析中被測(cè)定，通過比較樣品中交叉試劑的實(shí)際濃度，可以計(jì)算出交叉反應(yīng)，并用百分比(%)表示。
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