環(huán)腺苷酸（cAMP）ELISA檢測試劑盒

貨號: BK101

批號: 11A601

 保質(zhì)期：6個月

背景介紹

cAMP和cGMP都是小分子的環(huán)狀核苷酸，以微量存在于動植物細胞和微生物中，被稱其為細胞內(nèi)的第二信使（激素為信使）。

cAMP（或cGMP）由腺苷酸（或鳥苷酸）環(huán)化酶產(chǎn)生，被磷酸二酯酶降解，因此激活腺苷酸（或鳥苷酸）環(huán)化酶或者抑制磷酸二酯酶，可以提高細胞內(nèi)cAMP（或cGMP）的含量。研究發(fā)現(xiàn)，cAMP（或cGMP）特異性磷酸二酯酶的抑制劑可用于人類疾病的治療。如：增強β腎上腺素能受體（cAMP的封閉劑）已被用于心率失調(diào)、高血壓、心肌梗死等心臟疾?。?/span>cAMP特異性磷酸二酯酶2/4的抑制劑正在進行認知增強方面的臨床測試；而cGMP特異性磷酸二酯酶類型5可用于治療ED等疾病。

在五十年的研究歷程中，從開始研究cAMP，cGMP在各種生理過程中的調(diào)節(jié)作用，到近幾年與之相關的藥物研發(fā)，藥物篩選領域，人們一直在努力尋找一種快速、靈敏、特異性和可重復地定量檢測cAMP和cGMP含量的方法。

cAMP，cGMP分子量分別只有329.21和345.21，在機體內(nèi)的含量極低，為pmol/L級別，用一般的分析方法無法測定。70年代一系列測定cAMP和cGMP的方法被發(fā)明出來，最基本的原理有三種：分別是競爭性蛋白質(zhì)結(jié)合分析法、放射性免疫分析法和薄層色譜法。

本試劑盒利用競爭酶聯(lián)免疫分析方法來測定細胞提取物或體外腺苷酸環(huán)化酶實驗中的cAMP的水平。包被羊抗鼠多克隆抗體在酶標板上，細胞提取物或體外腺苷酸環(huán)化酶實驗中的cAMP與固定數(shù)量的標記辣根過氧化物酶的cAMP競爭性的結(jié)合抗cAMP單克隆抗體，采用已知濃度的cAMP標準品來做標準曲線。檢測450nm波長下的OD值，吸光度OD值與樣品中cAMP的濃度呈反比關系。基于cAMP標準品所得曲線，通過測得的OD值可以計算出樣品中cAMP的濃度，本試劑盒IC50（50% B/B0）約12pmol/mL，檢測限約0.15 pmol/mL。

試劑盒組成

所需材料

酶標儀（檢測波長450 nm，參比波長630nm）

各種型號加樣槍和槍頭

EP管

微孔板振蕩器

吸水紙

去離子水

樣本處理

1. 組織樣本：新鮮收集的組織樣本必須立即凍存在液氮中。使用前去除冰凍樣本

稱重，加入5-10倍體積的0.1M HCl。用勻漿器在冰上勻漿。然后室溫離心5min（＞600 g）。留上清，可以直接實驗，或用0.1M HCl稀釋。

2. 細胞樣本：去除培養(yǎng)基，加入適量0.1M HCl（在0.1M HCl中加入0.1%~1%

Triton X-100可增強細胞的溶解效果），放置10min，期間觀察以確認細胞是否發(fā)生溶解。如果溶解不充分，可以再增加10min，直至細胞完全溶解。室溫離心5min（600 g）。留上清，用于本試劑盒檢測。注：上述濃度的Triton X-100不會影響樣品與板的結(jié)合，但可能會增加背景值，建議用含相同濃度Triton X-100稀釋標準品，以去除誤差。

3. 尿液、血漿和培養(yǎng)液：每ml樣品中加入10μL濃鹽酸（12M），混勻后，室溫離心

5min（600 g），留上清，用于本試劑盒檢測。血漿、血清、全血和組織勻漿通常含有磷酸二酯酶（phosphodiesterases）和大量免疫球蛋白（Ig），它們會干擾實驗。用0.1 M HCl處理樣品，可以滅活磷酸二酯酶和降低免疫球蛋白的濃度，使之可以用于本試劑盒。磷酸二酯酶和免疫球蛋白也可以通過加入5% TCA（三氯乙酸）使之沉淀或用截留分子量10 KD的超濾離心管去除。

注意事項

1. 本試劑盒所有相關試劑均預先平衡至室溫（20-25℃）。

2. 各孔分別加入標準品和樣品。

3. 沿孔壁加入各試劑，避免交叉污染。

4. 本試劑盒提供的是可分拆的孔板條，使用者可以按照樣品數(shù)量選擇使用量。未用的孔板請放回原封口袋，保存在4℃?？装逭埛旁诒驹噭┖信渌偷目装寮苌鲜褂?。

5. 加入底物前，請確?？字袥]有殘余液體。

6. 終止液具有腐蝕性，請小心使用。

試劑準備

1. cAMP標準品溶液配制
    取8個新EP管，分別標記1-8#。在1#管中加入980 μL0.1M HCl，2-8#管中分別加500 μL0.1M HCl。加入20μL標準品（10000 pmol/mL）到1#管中，劇烈振蕩。從1#管中取去500μL加入2#管，劇烈振蕩。同樣方法完成3-8#管的稀釋（1-8#管cAMP濃度分別是200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56pmol/mL）。稀釋好的標準品建議在15min內(nèi)使用。另外，標記一個新EP管為B0（maximum binding，0pmol/mL），加入500μL 0.1M HCl。

2. “Assay Buffer工作液”的準備
將本試劑盒的Assay Buffer（10×）（30 mL） 加入270 mL去離子水中。
注：配好的Assay Buffer工作液可室溫保存3個月（但不能超出試劑盒的保質(zhì)期）

3. “cAMP-HRP Conjugate工作液”的準備
用配好的Assay Buffer按1:1000 將cAMP-HRP Conjugate（1000×）稀釋至工作液，此工作液再稀釋20倍作為TA孔的HRP結(jié)合物工作液。

4.   “Anti-cAMP McAb工作液”的準備
用配好的Assay Buffer按1:1000 將Anti-cAMP McAb（1000×）稀釋至工作液。

實驗步驟

1. 每個孔中加入50 μLNeutralizing Buffer。TA （Total Activity）和空白孔除外。

2. 加50 μL0.1M HCl至NSB孔（Non-Specific Binding）和B0孔。 

3. 分別取50 μL各濃度標準品溶液至相應孔中。.

4. 取50 μL樣品溶液至相應孔中。 

5. 各取50 μLAssay Buffer工作液至NSB孔中。 

6. 取50 μLcAMP-HRP Conjugate工作液至各孔中（TA和空白孔不加）。 

7. 取50 μLAnti-cAMP monoclonal antibody至各孔中（TA、空白和NSB孔不加）。 

8. 室溫孵育2 h。 

9. 倒空，用Assay Buffer工作液洗4遍，每次倒干凈殘余液體。 

10. 加入5 μLcAMP-HRP Conjugate工作液至TA孔中。 

11. 取150 μL TMB Substrate至各孔中，室溫靜置10min左右。  

12. 加50 μL Stop Solution至各孔中，并立即上酶標儀讀數(shù)（檢測波長為450nm，參比波長為630nm）。扣除每個讀數(shù)的Blank（空白）孔光密度值。

S1-S8: Standards 1-8        

SP1-SP72: samples

結(jié)果計算

1. 樣品和標準品的凈OD平均值的計算：

凈OD平均值=OD平均值-NSB孔OD平均值

2. 結(jié)合率（各濃度標準品的結(jié)合率占結(jié)合率（B0孔）的百分比）計算：

結(jié)合率（B/B0）=（凈OD平均值/B0孔OD平均值）×100

3. 用軟件（如Curve Expert或ELISA Calc）進行結(jié)合率（或凈OD平均值）對Log（cGMP標準品濃度）的三次多項式回歸曲線擬合（three order polynomial linear regression curve）或指數(shù)Logistic曲線擬合。

4. 通過樣品的結(jié)合率即可計算出樣品中cAMP濃度。

典型標準曲線   

注：每次實驗需重新制作標準曲線

注：通常相關系數(shù)R值大于0.99

交叉反應