環(huán)腺苷酸（cAMP）ELISA檢測(cè)試劑盒

貨號(hào): BK101

批號(hào): 11A601

 保質(zhì)期：6個(gè)月

背景介紹

cAMP和cGMP都是小分子的環(huán)狀核苷酸，以微量存在于動(dòng)植物細(xì)胞和微生物中，被稱其為細(xì)胞內(nèi)的第二信使（激素為信使）。

cAMP（或cGMP）由腺苷酸（或鳥(niǎo)苷酸）環(huán)化酶產(chǎn)生，被磷酸二酯酶降解，因此激活腺苷酸（或鳥(niǎo)苷酸）環(huán)化酶或者抑制磷酸二酯酶，可以提高細(xì)胞內(nèi)cAMP（或cGMP）的含量。研究發(fā)現(xiàn)，cAMP（或cGMP）特異性磷酸二酯酶的抑制劑可用于人類疾病的治療。如：增強(qiáng)β腎上腺素能受體（cAMP的封閉劑）已被用于心率失調(diào)、高血壓、心肌梗死等心臟疾病；cAMP特異性磷酸二酯酶2/4的抑制劑正在進(jìn)行認(rèn)知增強(qiáng)方面的臨床測(cè)試；而cGMP特異性磷酸二酯酶類型5可用于治療ED等疾病。

在五十年的研究歷程中，從開(kāi)始研究cAMP，cGMP在各種生理過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用，到近幾年與之相關(guān)的藥物研發(fā)，藥物篩選領(lǐng)域，人們一直在努力尋找一種快速、靈敏、特異性和可重復(fù)地定量檢測(cè)cAMP和cGMP含量的方法。

cAMP，cGMP分子量分別只有329.21和345.21，在機(jī)體內(nèi)的含量極低，為pmol/L級(jí)別，用一般的分析方法無(wú)法測(cè)定。70年代一系列測(cè)定cAMP和cGMP的方法被發(fā)明出來(lái)，最基本的原理有三種：分別是競(jìng)爭(zhēng)性蛋白質(zhì)結(jié)合分析法、放射性免疫分析法和薄層色譜法。

本試劑盒利用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法來(lái)測(cè)定細(xì)胞提取物或體外腺苷酸環(huán)化酶實(shí)驗(yàn)中的cAMP的水平。包被羊抗鼠多克隆抗體在酶標(biāo)板上，細(xì)胞提取物或體外腺苷酸環(huán)化酶實(shí)驗(yàn)中的cAMP與固定數(shù)量的標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶的cAMP競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合抗cAMP單克隆抗體，采用已知濃度的cAMP標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測(cè)450nm波長(zhǎng)下的OD值，吸光度OD值與樣品中cAMP的濃度呈反比關(guān)系?；?/span>cAMP標(biāo)準(zhǔn)品所得曲線，通過(guò)測(cè)得的OD值可以計(jì)算出樣品中cAMP的濃度，本試劑盒IC50（50% B/B0）約12pmol/mL，檢測(cè)限約0.15 pmol/mL。

試劑盒組成

所需材料

酶標(biāo)儀（檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，參比波長(zhǎng)630nm）

各種型號(hào)加樣槍和槍頭

EP管

微孔板振蕩器

吸水紙

去離子水

樣本處理

1. 組織樣本：新鮮收集的組織樣本必須立即凍存在液氮中。使用前去除冰凍樣本

稱重，加入5-10倍體積的0.1M HCl。用勻漿器在冰上勻漿。然后室溫離心5min（＞600 g）。留上清，可以直接實(shí)驗(yàn)，或用0.1M HCl稀釋。

2. 細(xì)胞樣本：去除培養(yǎng)基，加入適量0.1M HCl（在0.1M HCl中加入0.1%~1%

Triton X-100可增強(qiáng)細(xì)胞的溶解效果），放置10min，期間觀察以確認(rèn)細(xì)胞是否發(fā)生溶解。如果溶解不充分，可以再增加10min，直至細(xì)胞完全溶解。室溫離心5min（600 g）。留上清，用于本試劑盒檢測(cè)。注：上述濃度的Triton X-100不會(huì)影響樣品與板的結(jié)合，但可能會(huì)增加背景值，建議用含相同濃度Triton X-100稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，以去除誤差。

3. 尿液、血漿和培養(yǎng)液：每ml樣品中加入10μL濃鹽酸（12M），混勻后，室溫離心

5min（600 g），留上清，用于本試劑盒檢測(cè)。血漿、血清、全血和組織勻漿通常含有磷酸二酯酶（phosphodiesterases）和大量免疫球蛋白（Ig），它們會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)。用0.1 M HCl處理樣品，可以滅活磷酸二酯酶和降低免疫球蛋白的濃度，使之可以用于本試劑盒。磷酸二酯酶和免疫球蛋白也可以通過(guò)加入5% TCA（三氯乙酸）使之沉淀或用截留分子量10 KD的超濾離心管去除。

注意事項(xiàng)

1. 本試劑盒所有相關(guān)試劑均預(yù)先平衡至室溫（20-25℃）。

2. 各孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。

3. 沿孔壁加入各試劑，避免交叉污染。

4. 本試劑盒提供的是可分拆的孔板條，使用者可以按照樣品數(shù)量選擇使用量。未用的孔板請(qǐng)放回原封口袋，保存在4℃?？装逭?qǐng)放在本試劑盒配送的孔板架上使用。

5. 加入底物前，請(qǐng)確保孔中沒(méi)有殘余液體。

6. 終止液具有腐蝕性，請(qǐng)小心使用。

試劑準(zhǔn)備

1. cAMP標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制
    取8個(gè)新EP管，分別標(biāo)記1-8#。在1#管中加入980 μL0.1M HCl，2-8#管中分別加500 μL0.1M HCl。加入20μL標(biāo)準(zhǔn)品（10000 pmol/mL）到1#管中，劇烈振蕩。從1#管中取去500μL加入2#管，劇烈振蕩。同樣方法完成3-8#管的稀釋（1-8#管cAMP濃度分別是200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56pmol/mL）。稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品建議在15min內(nèi)使用。另外，標(biāo)記一個(gè)新EP管為B0（maximum binding，0pmol/mL），加入500μL 0.1M HCl。

2. “Assay Buffer工作液”的準(zhǔn)備
將本試劑盒的Assay Buffer（10×）（30 mL） 加入270 mL去離子水中。
注：配好的Assay Buffer工作液可室溫保存3個(gè)月（但不能超出試劑盒的保質(zhì)期）

3. “cAMP-HRP Conjugate工作液”的準(zhǔn)備
用配好的Assay Buffer按1:1000 將cAMP-HRP Conjugate（1000×）稀釋至工作液，此工作液再稀釋20倍作為TA孔的HRP結(jié)合物工作液。

4.   “Anti-cAMP McAb工作液”的準(zhǔn)備
用配好的Assay Buffer按1:1000 將Anti-cAMP McAb（1000×）稀釋至工作液。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 每個(gè)孔中加入50 μLNeutralizing Buffer。TA （Total Activity）和空白孔除外。

2. 加50 μL0.1M HCl至NSB孔（Non-Specific Binding）和B0孔。 

3. 分別取50 μL各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液至相應(yīng)孔中。.

4. 取50 μL樣品溶液至相應(yīng)孔中。 

5. 各取50 μLAssay Buffer工作液至NSB孔中。 

6. 取50 μLcAMP-HRP Conjugate工作液至各孔中（TA和空白孔不加）。 

7. 取50 μLAnti-cAMP monoclonal antibody至各孔中（TA、空白和NSB孔不加）。 

8. 室溫孵育2 h。 

9. 倒空，用Assay Buffer工作液洗4遍，每次倒干凈殘余液體。 

10. 加入5 μLcAMP-HRP Conjugate工作液至TA孔中。 

11. 取150 μL TMB Substrate至各孔中，室溫靜置10min左右。  

12. 加50 μL Stop Solution至各孔中，并立即上酶標(biāo)儀讀數(shù)（檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm，參比波長(zhǎng)為630nm）。扣除每個(gè)讀數(shù)的Blank（空白）孔光密度值。

S1-S8: Standards 1-8        

SP1-SP72: samples

結(jié)果計(jì)算

1. 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的凈OD平均值的計(jì)算：

凈OD平均值=OD平均值-NSB孔OD平均值

2. 結(jié)合率（各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)合率占結(jié)合率（B0孔）的百分比）計(jì)算：

結(jié)合率（B/B0）=（凈OD平均值/B0孔OD平均值）×100

3. 用軟件（如Curve Expert或ELISA Calc）進(jìn)行結(jié)合率（或凈OD平均值）對(duì)Log（cGMP標(biāo)準(zhǔn)品濃度）的三次多項(xiàng)式回歸曲線擬合（three order polynomial linear regression curve）或指數(shù)Logistic曲線擬合。

4. 通過(guò)樣品的結(jié)合率即可計(jì)算出樣品中cAMP濃度。

典型標(biāo)準(zhǔn)曲線   

注：每次實(shí)驗(yàn)需重新制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

注：通常相關(guān)系數(shù)R值大于0.99

交叉反應(yīng)