| 體外激酶實(shí)驗(yàn) | AKT2,PKA, p70S6K, 和 CDK2/cyclin A 的激酶實(shí)驗(yàn)在測(cè)量輻射的過(guò)濾器結(jié)合格式上進(jìn)行。在AT7867存在時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)反應(yīng)。為了測(cè)定AKT2,AKT2酶和 25 μM AKTide-2T 肽(HARKRERTYSFGHHA) 在 20 mM MOPS (pH 7.2), 25 mM β-甘油磷酸，5 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mM 釩酸鈉, 1 mM DTT, 10 μg/mL 牛血清蛋白，和 30 μM ATP (1.16 Ci/mmol) 中溫育4小時(shí)。為了測(cè)定PKA, PKA 酶和50 μM肽 (GRTGRRNSI) 在2 mM MOPS (pH 7.2), 25 mM β-甘油磷酸, 5 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mM 釩酸, 1 mM DTT, 和 40 μM ATP (0.88 Ci/mmol) 中溫育20分鐘。為了測(cè)定p70S6K, p70S6K 酶和 25 μM肽底物(AKRRRLSSLRA) 在 10 mM MOPS (pH 7), 0.2 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 0.01% β-巰基乙醇, 0.1 mg/mL 牛血清蛋白, 0.001% Brij-35, 0.5% 甘油,和15 μM ATP (2.3 Ci/mmol)中溫育60分鐘。為了測(cè)定 CDK2, CDK2/cyclin A 酶和 0.12 μg/mL 組蛋白 H1在 20 mM MOPS (pH 7.2), 25 mM β-甘油磷酸, 5 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mM 釩酸鈉, 1 mM DTT, 0.1 mg/mL 牛血清蛋白, 和 45 μM ATP (0.78 Ci/mmol) 中溫育4小時(shí)。所有反應(yīng)通過(guò)加入過(guò)量磷酸而終止。終止的反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到Millipore MAPH 過(guò)濾板上進(jìn)行過(guò)濾。沖洗實(shí)驗(yàn)板，加入閃爍劑，在Packard TopCount上通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)而測(cè)量放射性。通過(guò)復(fù)制曲線使用 GraphPad Prism 軟件計(jì)算IC50值。進(jìn)行AKT1和 AKT3酶實(shí)驗(yàn)。 |