產(chǎn)品簡(jiǎn)介
考馬斯亮蘭 G-250 染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的吸收峰的位置（Imax），由 465nm 變?yōu)?nbsp;595nm，在一定的濃度范圍內(nèi)，測(cè)定的吸光度值 A595 與蛋白質(zhì)濃度成正比。Bradford 法測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響，樣品中巰基乙*醇的濃度可高達(dá) 1M，二硫蘇糖醇的濃度可高達(dá) 5mM，但受略高濃度的去垢劑影響，需確保 SDS的濃度低于 0.1%，Triton X-100 低于 0.1%，Tween 20, 60, 80 低于 0.06%。含去垢劑的樣品推薦使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒。
操作說(shuō)明
一．微孔酶標(biāo)儀法
1. 完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取 10μL，稀釋至 250μL ，使終濃度為 0.2mg/ml。待測(cè)蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡(jiǎn)便起見(jiàn)，也可以用 0.9%NaCl 或PBS 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
2. 5×G250 染色液使用前請(qǐng)顛倒 3-5 次混勻，取 1ml 5×G250 染色液，加入 4ml 雙蒸水，混勻成 1×G250染色液，此 1×G250 染色液可在 4℃保存一周。
3. 將標(biāo)準(zhǔn)品按 0,2,4,6,8,12,16,20 微升分別加到 96 孔板中，加 PBS 稀釋液補(bǔ)足到 20 微升。
4. 將樣品作適當(dāng)稀釋?zhuān)ǘ嘧鰩讉€(gè)梯度，如作 2 倍、4 倍、8 倍稀釋?zhuān)?，?nbsp;20 微升到 96 孔板的樣品孔中。由于移液器在取小量時(shí)的誤差，標(biāo)準(zhǔn)線前面的點(diǎn)可能不很準(zhǔn)確，所以盡可能的讓樣品點(diǎn)落在標(biāo)準(zhǔn)線 1/2后。
5. 各孔加入 200 微升稀釋后的 1×G250 染色液，室溫放置 3-5 分鐘。
6. 用酶標(biāo)儀測(cè)定 A595，或 560-610nm 之間的其它波長(zhǎng)的吸光度。
7. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。
二．分光光度計(jì)法
如無(wú)酶標(biāo)儀，染色反應(yīng)可在離心管中進(jìn)行，反應(yīng)液混勻后加入比色皿中，使用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值。步驟如下：
1. 取八支（或者更多）干凈的 10ml 離心管，標(biāo)記上號(hào)。
2. 取 100μLBSA 加入 PBS 2.4ml 稀釋至終濃度為 0.2mg/ml。
3. 5×G250 染色液使用前請(qǐng)顛倒 3-5 次混勻，取 10ml 5×G250 染色液，加入 40ml 雙蒸水，混勻成 1×G250 染色液，此 1×G250 染色液可在 4℃保存一周。
4. 按下表加入試劑(以每孔 5ml 計(jì)，多余的用來(lái)清洗比色皿)