注意事項?
本產(chǎn)品為凍干粉形式，使用前請瞬時離心，加適當溶劑溶解后使用。?
儲存條件?
-20℃干燥、避光保存，自收貨之日起一年有效。若配制成水溶液，應小量分裝保存。
產(chǎn)品介紹?
鬼筆環(huán)肽是從致命的傘形毒蕈蘑菇中分離出來的一種毒素。 它是特異性結合于F-肌動蛋白的雙環(huán)肽（1）。因此用熒光染料標記的鬼筆環(huán)肽可以非常方便的研究F-肌動蛋白的分布。鬼筆環(huán)肽內(nèi)部，在半胱氨酸和色氨酸之間含有不常見的硫醚橋形成內(nèi)環(huán)結構。 在pH升高時，該硫醚被裂解，鬼筆環(huán)肽失去對肌動蛋白的親和力。
? ? 熒光標記的鬼筆環(huán)肽可在納摩爾水平染色F-肌動蛋白（1-3）。在各種植物細胞或動物細胞中，標記的鬼筆環(huán)肽對大、小細絲具有相似的親和力，平均每個肌動蛋白亞基結合一個鬼筆環(huán)肽分子。不同于抗體，鬼筆環(huán)肽與肌動蛋白的結合親和力在不同物種間沒有顯著變化。非特異性染色可以忽略不計，染色和未染色區(qū)域之間的對比度非常大。鬼筆環(huán)肽將單體/聚合物的平衡轉向聚合狀態(tài)，將聚合臨界濃度降低至30倍（3,4）。Phallotoxins可通過抑制細胞松弛素的解聚，碘化鉀和升高的溫度，穩(wěn)定F-肌動蛋白，。因為鬼筆環(huán)肽綴合物很小，大約直徑12-15埃，分子量<2000道爾頓，多種肌動蛋白結合蛋白，包括肌球蛋白，原肌球蛋白和后肌鈣蛋白依然可以和鬼筆環(huán)肽標記的肌動蛋白結合。更重要的是，鬼筆環(huán)肽標記的肌動蛋白絲保持功能，標記甘油肌纖維仍然收縮，標記的肌動蛋白絲仍然可以繼續(xù)移動（5,6）。而且熒光標記的鬼筆環(huán)肽也可用于對細胞中F-肌動蛋白進行定量研究（7,8）。
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實驗方法?
儲液制備?
熒光染料標記的鬼筆環(huán)肽：取適量甲醇或無菌水溶解棕色管中凍干的粉末，制備成200U/mL的儲液（300T規(guī)格染料加入1.5mL的液體）。?
熒光標記的標記鬼筆環(huán)肽的一個單位（T）的定義是染色一個加載細胞的載玻片所用染料的量。使用時的推薦稀釋比例為1:40-1:200，一個單位相當于200μL總染色體積中加入1-5μL 200U /mL儲備溶液。?
注：稀釋比例可以根據(jù)實際染色效果進行適當調整。
固定細胞染色?
以下方案是針對生長在玻璃蓋玻片或8孔室玻片上的貼壁細胞的染色步驟。鬼筆環(huán)肽也可用于染色固定的冷凍或石蠟組織切片。?
1. 用PBS清洗細胞3次。?
2 . 用含有3.75％甲醛的PBS溶液固定細胞，冰上固定15分鐘。?
注意：甲醇可以在固定過程中破壞肌動蛋白。因此避免含有任何甲醇的固定劑。優(yōu)選的固定劑是不含甲醇的甲醛。?
3. 用PBS清洗細胞3次。?
4. 用含0.5％Triton X-100的PBS溶液在室溫下透化細胞10分鐘。?
5. 用PBS清洗細胞3次。?
6. 用200μL PBS稀釋1-5μL熒光標記的鬼筆環(huán)肽儲液，加入一個蓋玻片或孔中，室溫孵育20min，進行染色。?
注：染色體積可根據(jù)樣本情況進行調節(jié)。孵育過程中為避免染液揮發(fā)，可將蓋玻片放于密封容器內(nèi)。?
7. 用PBS清洗細胞2-3次。?
8. 熒光顯微鏡觀察。此產(chǎn)品具有很好的光穩(wěn)定，樣品可以在PBS中成像，但為了效果，也可以使用抗熒光淬滅劑觀察。?
活細胞染色?
熒光標記的鬼筆環(huán)肽不具有細胞透性，因此沒有被廣范用于活細胞標記。 然而，有報道稱活細胞可能通過胞飲或未知機制進行標記（9-12）。 一般來說，染色活細胞時需要更多的染料。 或者熒光標記的鬼筆環(huán)肽也可被注入到細胞中用于監(jiān)測肌動蛋白分布和細胞運動（13-16）。
Reference?
1.Wieland, T. in Phallotoxins, Springer-Verlag, New York (1986);?
2. J Muscle Res Cell Motil 9, 370 (1988);?
3. Methods Enzymol 85, 514 (1982);?
4. Eur J Biochem 165, 125 (1987);?
5. Nature 326, 805 (1987);?
6. Proc Natl Acad Sci USA 83, 6272 (1986);?
7. Blood 69, 945 (1987);?
8. Anal Biochem 200, 199 (1992);?
9. J Cell Biol 105, 1473 (1987);?
10. Proc Natl Acad Sci USA 77, 980 (1980);?
11. Nature 284, 405 (1980);?
12. CRC Crit Rev Biochem 5, 185 (1978);?
13. J Cell Biol 106, 1229 (1988);?
14. J Cell Biol 103, 265a (1986);?
15. Eur J Cell Biol 24, 176 (1981);?
16. Proc Natl Acad Sci USA 74, 5613 (1977)
關鍵字： SF633標記鬼筆環(huán)肽（遠紅）;染料/染色劑
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