注意事項?
本產(chǎn)品為凍干粉形式,使用前請瞬時離心,加適當(dāng)溶劑溶解后使用。?
儲存條件?
-20℃干燥、避光保存,自收貨之日起一年有效。若配制成水溶液,應(yīng)小量分裝保存。
?產(chǎn)品介紹?
鬼筆環(huán)肽是從致命的傘形毒蕈蘑菇中分離出來的一種毒素。 它是特異性結(jié)合于F-肌動蛋白的雙環(huán)肽(1)。因此用熒光染料標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可以非常方便的研究F-肌動蛋白的分布。鬼筆環(huán)肽內(nèi)部,在半胱氨酸和色氨酸之間含有不常見的硫醚橋形成內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)。 在pH升高時,該硫醚被裂解,鬼筆環(huán)肽失去對肌動蛋白的親和力。
? ? 熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可在納摩爾水平染色F-肌動蛋白(1-3)。在各種植物細(xì)胞或動物細(xì)胞中,標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對大、小細(xì)絲具有相似的親和力,平均每個肌動蛋白亞基結(jié)合一個鬼筆環(huán)肽分子。不同于抗體,鬼筆環(huán)肽與肌動蛋白的結(jié)合親和力在不同物種間沒有顯著變化。非特異性染色可以忽略不計,染色和未染色區(qū)域之間的對比度非常大。鬼筆環(huán)肽將單體/聚合物的平衡轉(zhuǎn)向聚合狀態(tài),將聚合臨界濃度降低至30倍(3,4)。Phallotoxins可通過抑制細(xì)胞松弛素的解聚,碘化鉀和升高的溫度,穩(wěn)定F-肌動蛋白,。因為鬼筆環(huán)肽綴合物很小,大約直徑12-15埃,分子量<2000道爾頓,多種肌動蛋白結(jié)合蛋白,包括肌球蛋白,原肌球蛋白和后肌鈣蛋白依然可以和鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的肌動蛋白結(jié)合。更重要的是,鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的肌動蛋白絲保持功能,標(biāo)記甘油肌纖維仍然收縮,標(biāo)記的肌動蛋白絲仍然可以繼續(xù)移動(5,6)。而且熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽也可用于對細(xì)胞中F-肌動蛋白進(jìn)行定量研究(7,8)。
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?實驗方法?
儲液制備?
熒光染料標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽:取適量甲醇或無菌水溶解棕色管中凍干的粉末,制備成200U/mL的儲液(300T規(guī)格染料加入1.5mL的液體)。?
熒光標(biāo)記的標(biāo)記鬼筆環(huán)肽的一個單位(T)的定義是染色一個加載細(xì)胞的載玻片所用染料的量。使用時的推薦稀釋比例為1:40-1:200,一個單位相當(dāng)于200μL總?cè)旧w積中加入1-5μL 200U /mL儲備溶液。?
注:稀釋比例可以根據(jù)實際染色效果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
固定細(xì)胞染色?
以下方案是針對生長在玻璃蓋玻片或8孔室玻片上的貼壁細(xì)胞的染色步驟。鬼筆環(huán)肽也可用于染色固定的冷凍或石蠟組織切片。?
1. 用PBS清洗細(xì)胞3次。?
2 . 用含有3.75%甲醛的PBS溶液固定細(xì)胞,冰上固定15分鐘。?
注意:甲醇可以在固定過程中破壞肌動蛋白。因此避免含有任何甲醇的固定劑。優(yōu)選的固定劑是不含甲醇的甲醛。?
3. 用PBS清洗細(xì)胞3次。?
4. 用含0.5%Triton X-100的PBS溶液在室溫下透化細(xì)胞10分鐘。?
5. 用PBS清洗細(xì)胞3次。?
6. 用200μL PBS稀釋1-5μL熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽儲液,加入一個蓋玻片或孔中,室溫孵育20min,進(jìn)行染色。?
注:染色體積可根據(jù)樣本情況進(jìn)行調(diào)節(jié)。孵育過程中為避免染液揮發(fā),可將蓋玻片放于密封容器內(nèi)。?
7. 用PBS清洗細(xì)胞2-3次。?
8. 熒光顯微鏡觀察。此產(chǎn)品具有很好的光穩(wěn)定,樣品可以在PBS中成像,但為了效果,也可以使用抗熒光淬滅劑觀察。?
活細(xì)胞染色?
熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽不具有細(xì)胞透性,因此沒有被廣范用于活細(xì)胞標(biāo)記。 然而,有報道稱活細(xì)胞可能通過胞飲或未知機(jī)制進(jìn)行標(biāo)記(9-12)。 一般來說,染色活細(xì)胞時需要更多的染料。 或者熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽也可被注入到細(xì)胞中用于監(jiān)測肌動蛋白分布和細(xì)胞運(yùn)動(13-16)。
Reference?
1.Wieland, T. in Phallotoxins, Springer-Verlag, New York (1986);?
2. J Muscle Res Cell Motil 9, 370 (1988);?
3. Methods Enzymol 85, 514 (1982);?
4. Eur J Biochem 165, 125 (1987);?
5. Nature 326, 805 (1987);?
6. Proc Natl Acad Sci USA 83, 6272 (1986);?
7. Blood 69, 945 (1987);?
8. Anal Biochem 200, 199 (1992);?
9. J Cell Biol 105, 1473 (1987);?
10. Proc Natl Acad Sci USA 77, 980 (1980);?
11. Nature 284, 405 (1980);?
12. CRC Crit Rev Biochem 5, 185 (1978);?
13. J Cell Biol 106, 1229 (1988);?
14. J Cell Biol 103, 265a (1986);?
15. Eur J Cell Biol 24, 176 (1981);?
16. Proc Natl Acad Sci USA 74, 5613 (1977)
關(guān)鍵字: SF488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(綠色);染料/染色劑
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