??????Ad-mCherry-GFP-LC3B，即adenovirus expressing mCherry-GFP-LC3B fusion protein，是一種可以表達(dá)mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒，可以用于感染細(xì)胞或組織后進(jìn)行細(xì)胞自噬(autophagy)的檢測(cè)。
??????LC3是酵母自噬關(guān)鍵蛋白ATG8在哺乳動(dòng)物中的同源蛋白。LC3最初被分析鑒定為microtubule-associated protein 1 light chain 3 (MAP1LC3)。LC3蛋白家族包括LC3A、B、C和GABARAP等亞家族，其中對(duì)于LC3B的研究最為廣泛。到目前為止，
LC3B被認(rèn)為是細(xì)胞自噬信號(hào)通路最為關(guān)鍵的標(biāo)志性蛋白。LC3B是一個(gè)具有125個(gè)氨基酸殘基的蛋白，在蛋白合成后，被Atg4所酶切而失去了C端的22個(gè)氨基酸蛋白，從而暴露出C端的甘氨酸，人們把它命名為胞質(zhì)形式的LC3B I。在細(xì)胞自噬的過程中，其C端暴露的甘氨酸經(jīng)過一個(gè)類似泛素化的過程，以ATG7為E1樣激活酶(E1-like activating enzyme)， 以ATG3為E2樣連接酶(E2-like conjugation enzyme)，以Atg12-Atg5-Atg16復(fù)合物為E3樣連接酶(E3-like ligase)，在C端甘氨酸上共價(jià)連接上磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)而成為L(zhǎng)C3B-PE即LC3B II。與胞質(zhì)定位的LC3B I不同，LC3B II定位于自噬體
(autophagosome)的內(nèi)膜和外膜上。在自噬體與溶酶體融合后，自噬體外膜上的LC3B II被Atg4所酶切，而自噬體內(nèi)膜上的LC3B II則被溶酶體內(nèi)的蛋白酶所降解。盡管LC3B II比LC3B I的分子量要大，但由于其極強(qiáng)的疏水性，在SDS-PAGE電泳時(shí)，LC3B II比LC3B I遷移得更快，其表觀分子量分別為14kD和16kD。在用GFP-LC3B腺病毒感染細(xì)胞后，在非自噬的情況下，熒光顯微鏡下GFP-LC3B以彌散的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中；而在自噬的情況下，熒光顯微鏡下GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上，以斑點(diǎn)的形式表現(xiàn)出來(LC3B dots or punctae)。
??????自噬(Autophagy)是一種在進(jìn)化上高度保守的通過溶酶體吞噬并降解部分自身組分的細(xì)胞內(nèi)分解代謝途徑。自噬與多種生理功能有關(guān)，在饑餓等不利的環(huán)境條件下， 細(xì)胞通過自噬降解多余或異常的細(xì)胞內(nèi)組分，為細(xì)胞的生存提供能量及原材料，促進(jìn)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化及對(duì)環(huán)境變化產(chǎn)生應(yīng)答。自噬異常與多種病理過程如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、代謝疾病、病原體感染等都有密切關(guān)系。由于細(xì)胞自噬在生理和病理過程中都有重要作用，自噬已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。
??????Ad-mCherry-GFP-LC3B是碧云天自行研發(fā)的重組腺病毒，感染后能夠在靶細(xì)胞中有效表達(dá)紅色熒光蛋白mCherry、綠色熒光蛋白(GFP)和LC3B的融合蛋白，呈現(xiàn)明亮的紅色和綠色熒光，可以用于細(xì)胞自噬的檢測(cè)。
??????自噬小體在與溶酶體融合過程中，溶酶體內(nèi)的酸性環(huán)境會(huì)導(dǎo)致GFP熒光淬滅，這為追蹤GFP-LC3B的細(xì)胞定位增加了難度。mCherry是一種來自于蘑菇珊瑚(mushroom coral)的單體紅色熒光蛋白，當(dāng)其與GFP進(jìn)行LC3B的共同標(biāo)記時(shí)，在GFP被溶酶體酸性環(huán)境所淬滅的情況下，可以發(fā)出紅色熒光的mCherry因?yàn)槠渥吭降姆€(wěn)定性而被保留。因此，通過融合表達(dá)mCherry-GFP-LC3B蛋白，可以非常有效地追蹤自噬過程。在用Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染細(xì)胞后，在非自噬的情況下，熒光顯微鏡下mCherry-GFP-LC3B以彌散的黃色熒光(mCherry和GFP的綜合效果)形式存在于細(xì)胞質(zhì)中；而在自噬的情況下，熒光顯微鏡下mCherry-GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上，以黃色斑點(diǎn)的形式表現(xiàn)出來(LC3B dot or punctae)；當(dāng)自噬體與溶酶體融合后，因GFP熒光的部分淬滅而以紅色斑點(diǎn)的形式表現(xiàn)出來。
??????腺病毒感染細(xì)胞后為瞬時(shí)表達(dá)，通常不會(huì)與基因組DNA重組，不能用于篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。本產(chǎn)品感染體內(nèi)外細(xì)胞后，有效表達(dá)時(shí)間通常不少于7天，不同細(xì)胞和組織的有效表達(dá)時(shí)間有所不同。感染10-14天后融合蛋白的表達(dá)很可能會(huì)大大減弱。
??????碧云天的Ad-mCherry-GFP-LC3B采用了成熟的E1缺陷型重組腺病毒載體系統(tǒng)，感染普通的細(xì)胞后不能進(jìn)行擴(kuò)增和重組，從而可以有效降低本產(chǎn)品在活體生物中的風(fēng)險(xiǎn)。
??????本產(chǎn)品可以在表達(dá)E1的HEK293A、HEK293等適當(dāng)細(xì)胞中擴(kuò)增。
??????本產(chǎn)品的滴度≥1×10⁸?pfu/ml，使用時(shí)可以按照10⁸pfu/ml進(jìn)行計(jì)算。如果按照20 MOI感染6孔板的細(xì)胞，每孔50萬細(xì)胞計(jì)算，每毫升本產(chǎn)品共可以感染10個(gè)孔；如果按照20 MOI感染24孔板的細(xì)胞，每孔10萬細(xì)胞計(jì)算，每毫升本產(chǎn)品共可以感染50個(gè)孔。如果MOI值提高，則相應(yīng)可以感染的孔數(shù)會(huì)減少；如果MOI值降低，則相應(yīng)可以感染的孔數(shù)會(huì)增加。
包裝清單：

保存條件：
??????-80℃保存，一年有效。-20℃保存，1-2個(gè)月內(nèi)有效。4℃保存，一周內(nèi)有效。
注意事項(xiàng)：
??????反復(fù)凍融會(huì)降低病毒滴度，如有必要請(qǐng)?jiān)谑盏奖井a(chǎn)品后分裝保存。病毒融解后，如果在一周內(nèi)使用，可以放置于4℃。如果-80℃保存時(shí)間超過一年，可能會(huì)導(dǎo)致滴度下降，此時(shí)建議重新測(cè)定病毒滴度。
??????腺病毒感染需要細(xì)胞表面的CAR受體，請(qǐng)確認(rèn)擬使用的細(xì)胞或組織可以被腺病毒感染。
??????本產(chǎn)品使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀附錄1《腺病毒使用安全規(guī)范》。本產(chǎn)品生物安全等級(jí)為Biosafety Level 1 (BSL-1)，沒有確鑿證據(jù)顯示會(huì)導(dǎo)致健康成人產(chǎn)生疾病(Not known to consistently cause diseases in healthy adults)，可以按照常規(guī)的微生物實(shí)驗(yàn)操作要求進(jìn)行操作(Standard microbiological practices)。
??????本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
??????為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。