高純質(zhì)粒小提試劑盒（目錄號：RTP2101）

● 試劑盒內(nèi)容及保存：

● 儲存條件和效期：

本試劑盒在室溫（25℃左右）干燥條件下，可保存1年；更長時(shí)間的保存可置于2–8℃。2–8℃保存條件下，若溶液產(chǎn)生沉淀，應(yīng)在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。單獨(dú)包裝的RNase A 在-20℃可穩(wěn)定保存1年以上。加入RNase A后的溶液P1應(yīng)置于2–8℃保存，可穩(wěn)定保存半年。

● 產(chǎn)品簡介及使用說明：

本試劑盒采用經(jīng)典的堿裂解法裂解細(xì)菌，再通過離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合DNA的特性，可以從1–5ml大腸桿菌LB培養(yǎng)液中快速提取3–20μg純凈的高拷貝質(zhì)粒DNA。提取的質(zhì)?？蛇m用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測序、連接和轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)。然而，對質(zhì)粒純度要求更高的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)（要求無內(nèi)毒素），此試劑盒不能達(dá)到要求。另外，盡管該試劑盒可以抽提較大的質(zhì)粒（>10kb），但我們不推薦使用。如果一定要使用，請參考以下方法：加大菌體使用量（使用5–10 ml過夜培養(yǎng)物），同時(shí)按照比例增加P1、P2、P3的用量；洗脫緩沖液應(yīng)在70℃預(yù)熱，在吸附和洗脫時(shí)可以適當(dāng)?shù)难娱L時(shí)間，以增加提取效率，其它步驟相同。

● 產(chǎn)品特點(diǎn)：

1使用了Lysis Dye，菌體裂解是否完全一目了然。由于判斷菌體裂解和中和是否徹底更主要取決于操作者的經(jīng)驗(yàn)，所以我們增加了Lysis Dye（一種能使裂解/中和體系變換顏色的試劑）來幫助觀察裂解/中和的程度。加入P1后，Lysis Dye使菌液變?yōu)闇啙岬募t色；加入P2后，Lysis Dye立即使溶液變?yōu)槌吻宓募t色，裂解是否完全只要觀察紅色溶液是否澄清，如果紅色非常均一，表明裂解充分；在完全裂解的體系中加入P3混勻后，體系立即變?yōu)辄S色，任何紅色的殘留表明沒有完全混勻或者中和不徹底。

2 增加了去蛋白液PD，能更加徹底地去除蛋白污染，得到純度更高的質(zhì)粒。

● 準(zhǔn)備工作：

1 將試劑盒附帶的RNase A全部加入到溶液P1中（如15ml P1中加入150μl RNase A），混勻后4℃貯存。

2 按照標(biāo)簽所示在漂洗液PW中加入無水乙醇，混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存?zhèn)溆谩?/p>

3 每次使用前請檢查溶液P2，溶液P3和去蛋白液PD是否有沉淀生成，如果出現(xiàn)沉淀，37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。

● 使用Lysis Dye的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟：

如非指出，所有離心步驟均為使用臺式離心機(jī)在室溫下離心。

1．   取1–5 ml過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，10,000g 離心1分鐘，盡量吸除上清。

注：菌液較多時(shí)可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中。

2．   向菌體沉淀的離心管中加入250 μl溶液P1（請先檢查是否已加入RNaseA）和5μl Lysis Dye，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀，此時(shí)溶液為渾濁的紅色。

注：如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。

3．   加入250 μl溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6–8次使菌體充分裂解，此時(shí)溶液變?yōu)槌吻宓募t色。

注：溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免污染基因組DNA；所用時(shí)間絕對不應(yīng)超過5分鐘 ，以免質(zhì)粒受到破壞；紅色溶液應(yīng)該透明均一，如有渾濁紅色顆粒，表明裂解不充分，會大大降低質(zhì)粒提取效率。

4．   加入350 μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)，充分混勻，混勻充分的標(biāo)志是溶液完全呈透明的黃色，如有可見紅色，說明混勻不徹底。10,000g 離心10分鐘。

注：P3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。

5．  小心地將上清轉(zhuǎn)移到吸附柱CP中（吸附柱放入收集管中），10,000g離心30–60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP重新放回收集管中。

6．向吸附柱CP中加入500 μl去蛋白液PD，10,000g離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP重新放回收集管中。

7．  向吸附柱CP中加入700 μl漂洗液PW（請先檢查是否已加入無水乙醇），10,000g 離心30–60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP重新放回收集管中。

8. 向吸附柱CP中加入500 μl漂洗液PW，10,000g 離心30–60秒，倒掉收集管中的廢液。

9.  將吸附柱CP置于重新放回收集管中，10,000g 離心2分鐘。

注：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，絕對不可省略，因?yàn)槠匆褐幸掖嫉臍埩魰绊懞罄m(xù)實(shí)驗(yàn)（酶切，PCR等）。

10. 將吸附柱CP置于一個(gè)干凈的1.5ml離心管中，向吸附膜的中央部位懸空滴加50–100 μl洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘，10,000g 離心2分鐘將質(zhì)粒溶液收集到離心管中，-20℃保存。

注：● 為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入離心吸附柱中，再次離心收集。

● 洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50 μl，體積過小影響回收效率。

● 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會降低

洗脫效率。

●不使用Lysis Dye的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟：

如非指出，所有離心步驟均為使用臺式離心機(jī)在室溫下離心。

1．   取1–5 ml過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，10,000 g離心1分鐘，盡量吸除上清。

注：菌液較多時(shí)可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中。

2．   向菌體沉淀的離心管中加入250 μl溶液P1（請先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。

注：如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。

3．  加入250 μl溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6–8次使菌體充分裂解。

注：溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免污染基因組DNA；所用時(shí)間絕對不應(yīng)超過5分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞。

4．   加入350 μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6–8次，充分混勻，此時(shí)會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。10,000g 離心10分鐘。

注：P3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

5．  小心地將上清轉(zhuǎn)移到吸附柱CP中（吸附柱放入收集管中），10,000g 離心30–60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP重新放回收集管中。

6．向吸附柱CP中加入500 μl去蛋白液PD，10,000g離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP重新放回收集管中。

7．   向吸附柱CP中加入700 μl漂洗液PW（請先檢查是否已加入無水乙醇），10,000g 離心30–60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP重新放回收集管中。

7      向吸附柱CP中加入500 μl漂洗液PW，10,000g 離心30–60秒，倒掉收集管中的廢液。

8.  將吸附柱CP置于收集管中，10,000g 離心2分鐘。

注：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，絕對不可省略，因?yàn)槠匆褐幸掖嫉臍埩魰绊懞罄m(xù)實(shí)驗(yàn)（酶切，PCR等）。

9．   將吸附柱CP置于一個(gè)干凈的1.5ml離心管中，向吸附膜的中央部位懸空滴加50–100 μl洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘，10,000g離心2分鐘將質(zhì)粒溶液收集到離心管中，-20℃保存。