實(shí)驗(yàn)一、核染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）之——Chip-DNA
一、實(shí)驗(yàn)原理
染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)是一種適用于研究蛋白質(zhì)與生物體細(xì)胞中DNA相互作用的經(jīng)典方法，這項(xiàng)技術(shù)幫助研究者判斷在細(xì)胞核中基因組的某一特定位置會(huì)出現(xiàn)何種組蛋白修飾。將ChIP與第二代測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù)，能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段，研究體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子和靶基因啟動(dòng)子區(qū)域直接相互作用的方法，對(duì)于調(diào)控蛋白在基因組上的結(jié)合靶點(diǎn)篩選、差異化表觀遺傳變異的原理揭示提供了重要的解決思路。在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過(guò)免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1、樣品甲醛交聯(lián)固定、終止、收集樣品、裂解樣品
2、 超聲或者酶解處理樣品DNA成片段，瓊脂糖電泳檢測(cè)
3、樣品預(yù)處理：用Protein A/G Sepharose孵育
4、樣品與IP抗體進(jìn)行孵育
5、洗滌Protein A/G Sepharose-Antibody-Protein Complex，并對(duì)免疫復(fù)合物進(jìn)行變性處理，提取DNA樣品
6、檢測(cè)
1） 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)
2） DNA芯片檢測(cè)
3） DNA產(chǎn)物測(cè)序
三、研究方向
1、篩選調(diào)控蛋白在基因組上的結(jié)合靶點(diǎn)：針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子、DNA/RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物等調(diào)控因子蛋白進(jìn)行特異性的富集，分離純化與之結(jié)合的靶DNA片段并測(cè)序，分析篩選到準(zhǔn)確有效的靶位點(diǎn)、靶基因數(shù)據(jù)；
2、揭示差異化表觀遺傳變異的原理：通過(guò)對(duì)不同表型組織內(nèi)組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子蛋白及其他結(jié)合蛋白進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序并定量分析靶基因表達(dá)調(diào)控水平或針對(duì)同種組蛋白進(jìn)行甲基化、磷酸化、泛素化修飾所導(dǎo)致的結(jié)合位點(diǎn)變異進(jìn)行分析，即可準(zhǔn)確揭示差異化表觀變異原理；
3、研究表觀遺傳變異疾?。?/strong>借助染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息分析揭示由蛋白與DNA相互作用變異而引起的疾病的原理，明確表觀遺傳修飾在癌癥等表觀遺傳變異疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體作用機(jī)制。
四、結(jié)果提供
1、ChIP-DNA：分布在100～500bp范圍，且主要片段在～250bp；
2、總量≥5ng；
3、Input率；
4、陰性對(duì)照抗體對(duì)目的片段的富集程度小于檢測(cè)抗體2倍以上。
五、標(biāo)本要求及其它要求
1、動(dòng)物：細(xì)胞系、低脂肪含量組織液氮速凍樣本（細(xì)胞數(shù)大于5×106個(gè)）；
2、抗體：嘉美實(shí)驗(yàn)提供?；蛘呖蛻暨M(jìn)口IP級(jí)別抗體/非商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)抗體（需檢測(cè)）；
3、樣品運(yùn)輸：干冰運(yùn)輸，建議用滅菌的樣品袋或LoBind 管，parafilm將管口密封好；
4、目的基因或轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)背景資料。
實(shí)驗(yàn)二、核染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）之——Chip-Seq
一、實(shí)驗(yàn)原理
1、CHIP-seq，指的是結(jié)合位點(diǎn)分析法，作用為研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用。染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也稱結(jié)合位點(diǎn)分析法，是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具，通常用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)或組蛋白特異性修飾位點(diǎn)的研究。
2、將ChIP與第二代測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù)，能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段。ChIP-Seq的原理是：首先通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，并對(duì)其進(jìn)行純化與文庫(kù)構(gòu)建；然后對(duì)富集得到的DNA片段進(jìn)行高通量測(cè)序。研究人員通過(guò)將獲得的數(shù)百萬(wàn)條序列標(biāo)簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段信息。
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1）甲醛交聯(lián)整個(gè)細(xì)胞系（組織），即將目標(biāo)蛋白與染色質(zhì)連結(jié)起來(lái)；
2）分離基因組DNA，并用超聲波將其打斷成一定長(zhǎng)度的小片段；
3）添加與目標(biāo)蛋白質(zhì)特異的抗體，該抗體與目標(biāo)蛋白形成免疫沉淀免疫結(jié)合復(fù)合體；
4）去交聯(lián)，純化DNA即得到染色質(zhì)免疫沉淀的DNA樣本，準(zhǔn)備測(cè)序；
5）將準(zhǔn)備好的樣本進(jìn)行深度測(cè)序。
三、生物信息分析流程
1）將測(cè)序得到的短序列片段匹配到參考基因組序列上。
2）有一部分短序列不能匹配到參考基因組上，有可能是未知的基因組序列；另一部分是能夠匹配到基因組上的短序列，通常要對(duì)這些短序列進(jìn)行覆蓋度計(jì)算。
3）從匹配到基因組上的短序列中進(jìn)行富集區(qū)域的掃描。通常掃描到的富集區(qū)即被認(rèn)為是蛋白質(zhì)與DNA相互結(jié)合的區(qū)域（也有假陽(yáng)性位點(diǎn)等的影響）。
4）對(duì)掃描到的富集區(qū)做深度分析，包括基因，GO注釋，利用基因?yàn)g覽器進(jìn)行可視化瀏覽，研究與基因結(jié)構(gòu)的關(guān)系等。