2、次日收集上清液，將上清液移入離心管中 2000rpm 離心10min，-70℃儲存?zhèn)溆谩?/div>
3、根據(jù)細(xì)胞計數(shù)調(diào)整各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的蛋白濃度（或者測定蛋白濃度調(diào)整使所上蛋白總量一致）。與5×上樣緩沖液混合，13ul樣本+4ul上樣緩沖液。（不要用槍用力吹打，防止出現(xiàn)過多氣泡）
4、配制分離膠和濃縮膠，16ul/孔上樣（根據(jù)表達(dá)強度和蛋白濃度確定上樣量），4℃進行SDS-PAGE 電泳100v約1.5小時（電泳時在周圍敷上冰，有利于使條帶跑直）。
5、電泳結(jié)束后，將凝膠置于洗脫液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振蕩洗脫2次,每次40分鐘,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脫液) 漂洗2次，每次20分鐘，接著，將凝膠置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃ 孵育42h。
6、孵育結(jié)束后經(jīng)染色液(0.05% Coomassic 亮藍(lán)、30%甲醇、10%乙酸) 染色3h，及脫色液A、B、C(甲醇濃度分別為30%、20%、10 % ,乙酸濃度分別為10 %、10 %、5%) 分別脫色0.5、1、2h后，顯示出MMP-2（72KD） 和MMP -9（92 KD）為位于藍(lán)色背景上的透亮帶，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析讀取條帶面積，寬度和灰度值，做統(tǒng)計分析。
三、注意事項
1、制備聚丙烯酰胺時應(yīng)注意排除氣泡 。
2、明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和PH值等因素的影響，因此緩沖液 配制應(yīng)嚴(yán)格準(zhǔn)確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。
3、用大梳子。
4、孵育液的PH在7.5-7.6，復(fù)性的TRITON時間長了會有絮狀物，所以實驗時盡量使用新鮮配置的。
5、孵育的37度不要在CO2培養(yǎng)箱中，因為會改變孵育液的PH值，在普通孵箱即可。
6、明膠要4度保存，配好后1周內(nèi)使用。
四、凝膠制備
1、玻璃板對齊后放入夾中，垂直卡緊，加滿水檢漏。
2、配10%分離膠，APS和TEMED作用為促凝，最后灌膠前加。若板不漏水，則將水倒出，并用吸水紙洗凈后灌膠，灌至大約3/4處，上面加滿水壓平。
3、配濃縮膠，同樣地，APS和TEMED最后加，分離膠灌入約30min后觀察小燒杯中剩余分離膠是否已凝，同時仔細(xì)觀察可見玻板水和膠間有一條折線，說明膠已凝固。
4、將上面的水倒去，吸水紙洗凈，灌入濃縮膠，灌滿，注意一定不要有氣泡，然后將梳子插入，注意保持水平，約30min后凝固可用。
5、拔梳子在電泳緩沖液中拔，加樣孔用小針筒沖洗干凈再上樣，注意上樣時勿使樣品逸至鄰孔，樣品混勻時要輕，不要產(chǎn)生氣泡，否則加樣時易導(dǎo)致逸出而使結(jié)果不準(zhǔn)確。