microRNA熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green熒光染料)采用特異性的上下游引物對(duì)反轉(zhuǎn)錄所得microRNA的cDNA產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)。不同于其它公司的單條特異性引物擴(kuò)增方法，Biorab采用雙向特異性擴(kuò)增引物（原理如圖1），從而極大提高了miRNA的檢測(cè)特異性，其可以區(qū)分極高相似度的miRNA分子、減少非特異性擴(kuò)增（圖2，3所示）。該miRNA熒光定量PCR試劑盒對(duì)可以對(duì)任何miRNA分子進(jìn)行檢測(cè)。miRNA熒光定量PCR試劑盒共有一萬(wàn)余種，試劑盒編號(hào)為MTAXXXXX，每一個(gè)miRNA分子對(duì)應(yīng)一個(gè)檢測(cè)試劑盒，可下載SYBR Green miRNA qPCR kit列表查詢。如果您研究的miRNA分子不在我們的列表中，請(qǐng)來(lái)信咨詢，我們將及時(shí)給您優(yōu)化設(shè)計(jì)。該試劑盒中的每一對(duì)引物均經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)優(yōu)化，確保擴(kuò)增效率和特異性。
產(chǎn)品組成：
2×Hi SYBR Green qPCR Mix
1ml
50×ROX Reference Dye
200μl
microRNA Primer F（10μM）
100μl
microRNA Primer R（10μM）
100μl
microRNA 標(biāo)準(zhǔn)品(1pM)
100μl
儲(chǔ)存：請(qǐng)置于-20℃，可保存2年；避免反復(fù)凍融。
操作方法：
1．按以下組分配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)需購(gòu)買我司的一步法microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒)：
4×One step miRNA RT Solution
5μl
Rnase-Free H2O
Up to 20μl
2．在PCR 儀上按以下條件進(jìn)行反應(yīng):
37℃——————60min
95℃——————5分鐘
3．獲得 cDNA 產(chǎn)物后使用microRNA 熒光定量 PCR 試劑盒進(jìn)行 miRNA 定量檢測(cè)。根據(jù)機(jī)型選擇步驟A或B配制反應(yīng)體系：
步驟A：需要添加 ROX 染料進(jìn)行反應(yīng)孔間信號(hào)矯正的Real-Time PCR 儀，包括：ABI PRISM 7900HT、7300、7500 Real-TimePCR（Applied Biosystems)；Mx3000P（Stratagene)等。按照如下組分配制 20μl PCR 反應(yīng)體系：
2×Hi SYBR Green qPCR Mix
10μl
1×
50×ROX Reference Dye
0.4μl
1×
miRNA Primer F(10μM)
0.4μl
miRNA Primer R(10μM)
0.4μl
注：引物初次使用請(qǐng)用0.4μl，視實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。
步驟B：無(wú)需添加 ROX 染料進(jìn)行反應(yīng)孔間信號(hào)矯正的RealTime PCR 儀，包括：LightCycler（Roche Diagnostics)；MiniOpticon、Opticon2、MyiQ 2、CFX96 Real-TimePCR(Bio-Rad & MJ)；Line-Gene(Bioer，杭州博日)等。按照如下組分配制 20μl PCR 反應(yīng)體系：
2×Hi SYBR Green qPCR Mix
10μl
1×
miRNA Primer F(10μM)
0.4μl
miRNA Primer R(10μM)
0.4μl
注：引物初次使用請(qǐng)用0.4μl，視實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。
4．進(jìn)行 Real-Time PCR 反應(yīng)，通常采用兩步法，程序如下：
程序
溫度
時(shí)間
循環(huán)數(shù)
Stage 3：
Dissociation analysis
注意：使用該方法通常可以準(zhǔn)確檢測(cè)到>0.01fM的microRNA 分子，過(guò)多的循環(huán)數(shù)會(huì)造成精確性降低。推薦的循環(huán)數(shù)為 30 個(gè)，在檢測(cè)極低樣品濃度時(shí)可將循環(huán)數(shù)調(diào)整到 35 個(gè)。
5．?dāng)U增結(jié)果分析和數(shù)據(jù)處理：
反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn) Real-Time PCR的cDNA 樣品和 NTC 陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線和融解曲線。
6．標(biāo)準(zhǔn)品的使用
該試劑盒配備的標(biāo)準(zhǔn)品為單鏈 DNA 分子，其與目標(biāo)microRNA 分子反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物完全相同，因此可直接用于 PCR擴(kuò)增，從而檢測(cè) PCR 體系的可靠性。其濃度為 1pM，通常20μl PCR 體系中加入1μl，可獲得 Ct 值在15 左右的數(shù)據(jù)。除此外，可以使用TE Buffer 進(jìn)行稀釋，最低可稀釋到0.01fM，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增或絕對(duì)定量試驗(yàn)。
常用內(nèi)參miRNA熒光定量PCR試劑盒(染料法)
MTA01501
RNU6B
哺乳動(dòng)物
關(guān)鍵字： MICRORNA熒光定量PCR試劑盒_熒光定量_PCR試劑盒_
北京百奧萊博科技有限公司一家專注于生命科學(xué)研究領(lǐng)域的生物技術(shù)公司，堅(jiān)持“質(zhì)量至上，服務(wù)為本，全心全意助力生命科學(xué)”的理念，為廣大用于提供穩(wěn)定、可靠、專業(yè)的產(chǎn)品和服務(wù)支持，產(chǎn)品線包括分子生物學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，免疫檢測(cè)，抗體，重組蛋白，血液制品等系列?！懊γβ德档钠椒?，鑄就事業(yè)的不凡”。讓我們攜起手來(lái)，共同創(chuàng)造生命科學(xué)的蓬勃發(fā)展。