BCA蛋白定量試劑盒

Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination

BSA標(biāo)準(zhǔn)品為5 mg/ml BSA，溶于水中，含0.05%疊氮鈉。

室溫運(yùn)輸和儲存。如因溫度低或長時間放置出現(xiàn)沉淀，將其搖勻即可使用。BSA標(biāo)準(zhǔn)品保存在-20度，如出現(xiàn)微生物污染則應(yīng)丟棄。

產(chǎn)品簡介

BCA蛋白定量試劑盒是一種基于二喹啉甲酸比色法的總蛋白檢測和定量試劑盒，比Lowry法更為優(yōu)越。BCA蛋白定量法以快速靈敏、穩(wěn)定可靠且對不同種類蛋白質(zhì)變異系數(shù)甚小而深受專業(yè)人士的青睞，樣品中離子型和非離子型去污劑對其影響較小，檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于考馬斯亮藍(lán)。BCA法的原理：在堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)將銅離子還原成亞銅離子，二喹啉甲酸（BCA）與亞銅離子形成紫色的絡(luò)合物，這種絡(luò)合物溶于水并在562 nm處產(chǎn)生光吸收峰值，光吸收強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)含量呈近似線性關(guān)系，因此使用比色法可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測和定量。BCA法沒有反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)會隨著時間而持續(xù)進(jìn)行；通過一段時間的孵育后，反應(yīng)速度會變慢，從而可以對大量樣品進(jìn)行檢測。

在蛋白質(zhì)的大分子結(jié)構(gòu)中，與BCA反應(yīng)顏色形成相關(guān)的是肽鍵和四種氨基酸（半胱氨酸，胱氨酸，色氨酸，以及酪氨酸）。對二肽、三肽和四肽的研究表明，反應(yīng)顏色的形成不僅僅是單個的功能基團(tuán)效果疊加的結(jié)果。因此，蛋白濃度通常是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對照蛋白（常用牛血清白蛋白BSA）推測而來的，即：將標(biāo)準(zhǔn)對照蛋白的光吸收值做一個濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知樣品的光吸收值參照曲線方程計算出蛋白濃度值。

標(biāo)準(zhǔn)蛋白和工作液的配制

2. 配制牛血清白蛋白梯度：可根據(jù)檢測范圍和預(yù)估的樣品蛋白濃度來配制BSA濃度梯度，使用與待測樣品相同的溶劑?？砂幢壤糯蠡蚩s小，根據(jù)實(shí)際需要計算所需用量。

B.       BCA工作液的配制

1.        根據(jù)需要測定的未知樣品和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量以及復(fù)孔數(shù)來計算所需的BCA工作液體積。如使用試管進(jìn)行測試，每管需2.0 ml工作液, 而使用96孔板進(jìn)行測試則每孔需200 μl 工作液。

2.        按 組份A:組份B=50:1 的比例配制BCA工作液。組份B加入組份A的時候，開始會出現(xiàn)渾濁并隨著混勻很快消失，最終混勻后溶液呈蘋果綠色。配置好的工作液在室溫密閉的條件下24小時內(nèi)穩(wěn)定。

操作步驟

1.        如在試管中進(jìn)行反應(yīng)，取100 μl的BSA蛋白梯度或者待測樣品，放入標(biāo)記好的試管中，再每管加入2.0 ml工作液，充分混勻， 蓋上蓋子，并在選定的溫度條件下孵育：

·          室溫:                             室溫孵育 2 hours (檢測范圍： 20-2000 μg/ml)

·          37度:                            37°C 孵育30 minutes (檢測范圍： 20-2000 μg/ml)

·          60度：               60°C 孵育30 minutes (檢測范圍： 5-250 μg/ml)

延長孵育時間會增加光吸收值；應(yīng)使用水浴法加熱，以使得溫度均衡上升；用鼓風(fēng)法升溫會導(dǎo)致溫度不均衡，使實(shí)驗(yàn)誤差增大。

2.        如需在96孔板中進(jìn)行反應(yīng)，則每孔放入10 μl的BSA蛋白梯度或者待測樣品，再加入200 μl工作液，充分混勻，37度孵育30分鐘，檢測范圍為125-2000 μg/ml；也可以將BSA蛋白梯度和待測樣品提高到每孔25 μl，再加入200 μl工作液，充分混勻，37度孵育30分鐘，此時檢測范圍為20-2000 μg/ml，但是可能會較多受到樣品中的干擾物質(zhì)的干擾；應(yīng)使用水浴法加熱。

3.        將試管或96孔板冷卻至室溫。

4.        用分光光度計或酶標(biāo)儀在562 nm處讀取光吸收值, 所有樣品應(yīng)在10分鐘內(nèi)讀完。因?yàn)锽CA反應(yīng)沒有終點(diǎn)，隨著時間的推移光吸收值會繼續(xù)上升，在10分鐘內(nèi)讀完所有樣品可以避免產(chǎn)生明顯的誤差。

5.        將BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品的光吸收值減去空白對照值，以得到的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品光吸收值對蛋白濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)這個曲線方程計算待測樣品的蛋白濃度。

注意事項(xiàng)：

·          測定蛋白濃度時，使未知樣品的蛋白濃度處于標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線的接近中間位置，這樣獲得的結(jié)果更準(zhǔn)確。

·          通過增加孵育時間或者提高樣品比例，可以提高光吸收值，從而檢測更低的蛋白量，但是會縮小檢測范圍，可根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行調(diào)整，同時注意不要超過儀器的檢測上限。

·          最適檢測波長為562 nm。在540 nm到590 nm區(qū)間也可進(jìn)行檢測, 但標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和檢測靈敏度都會有所降低。

·          酶標(biāo)儀的檢測光徑比分光光度計的比色杯短，因而檢測靈敏度有所降低。

·          對酶標(biāo)儀的讀數(shù)進(jìn)行曲線擬合時， 采用four-parameter (quadratic) 或 best-fit curve 進(jìn)行擬合可以獲得比線性擬合更準(zhǔn)確的結(jié)果；手工擬合時可采用線性擬合法。

·          EDTA濃度必須小于10 mM，不兼容EGTA。不適用BCA法時，請使用Bradford蛋白濃度測定法。

·          每種常用的總蛋白測定方法測定不同的蛋白時都有一些偏差。導(dǎo)致產(chǎn)生這些偏差的原因有：蛋白質(zhì)的氨基酸序列，等電點(diǎn)，蛋白的結(jié)構(gòu)，特定種類的氨基酸側(cè)鏈和輔基。有些種類的氨基酸側(cè)鏈和輔基能對顯色反應(yīng)產(chǎn)生很大的影響。大部分蛋白測定方法都使用牛血清白蛋白（BSA）或免疫球蛋白(IgG)作為標(biāo)準(zhǔn)品來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果需要特別精確的檢測結(jié)果，可以使用待測蛋白的純品來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

·          一些物質(zhì)可以干擾BCA反應(yīng)，如還原劑、絡(luò)合劑，以及強(qiáng)酸和強(qiáng)堿。還有一些物質(zhì)干擾較小，只要不超過兼容濃度即不影響反應(yīng)的進(jìn)行。

·          本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。

·          為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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