品名：Smart-meRIP? meRIP Kit，貨號(hào)：meRIP-1001，品牌：Engibody
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NIH、麻省理工、哈佛、斯坦福等世界名校課題組青睞并長期采購的meRIP試劑盒！
磁珠法methylated RNA免疫沉淀試劑盒
Smart-meRIP? 保姆級(jí)meRIP試劑盒的優(yōu)勢(shì)
1、本kit適用于來自細(xì)胞、動(dòng)物組織、植物組織、血液及包埋組織的total RNA、mRNA、lncRNA及circRNA等的甲基化分析。
2、搭配不同抗體，可以檢測不同甲基化類型，例如m6A、m5C、m7G。
3、本kit適用于細(xì)胞漿RNA甲基化及細(xì)胞核RNA甲基化。
4、本kit采用優(yōu)化的洗脫體系，信噪比優(yōu)于采用游離m6A洗脫的MeRIP流程。
5、本kit包含陰性對(duì)照lgG抗體，方便IP實(shí)驗(yàn)質(zhì)控。
6、本試劑盒適配下游RT-qPCR以及特定甲基化的全轉(zhuǎn)錄組測序。
第一部分：背景簡介
RNA轉(zhuǎn)錄后修飾
RNA修飾開始被認(rèn)為僅僅是RNA在核酸結(jié)構(gòu)上的化學(xué)微調(diào)，隨著前沿研究技術(shù)的發(fā)展以及相關(guān)抗體的出現(xiàn)，當(dāng)前發(fā)現(xiàn)RNA修飾在轉(zhuǎn)錄組水平廣泛存在，并且是可逆的動(dòng)態(tài)調(diào)控狀態(tài)，參與生物進(jìn)程的多方面，包括：細(xì)胞分化、性別決定、腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移、DNA的損傷修復(fù)等生物學(xué)功能。
由于甲基化修飾約占所有RNA修飾的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A），作為最常見的一種轉(zhuǎn)錄后修飾，在RNA甲基化中占比超過80%。
常見5種RNA甲基化修飾類型(m6A, m6Am, m5C, m1A, m7G)
m6A
m6A（N6-methyladenosine，6-甲基腺嘌呤）是真核生物mRNA內(nèi)部序列中最常見的一種甲基化修飾，同時(shí)可以功能性的調(diào)節(jié)真核生物的轉(zhuǎn)錄組從而影響mRNA的剪接、出核、定位、翻譯和穩(wěn)定。m6A RNA出現(xiàn)在多種重要的細(xì)胞生命過程中，意味著mRNA甲基化參與了多種生物學(xué)過程，如干細(xì)胞分化、生物節(jié)律等，同時(shí)也參與了多種疾病的發(fā)生，包括腫瘤、肥胖和不育等。
目前對(duì)m6A的轉(zhuǎn)錄組研究方法為MeRIP-seq（mRNA甲基化測序）的方法，其原理是通過m6A特異性抗體對(duì)細(xì)胞內(nèi)具有m6A修飾的RNA片段進(jìn)行免疫共沉淀，將富集下來的RNA片段進(jìn)行高通量測序。結(jié)合生物信息學(xué)分析，即可在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)對(duì)m6A修飾進(jìn)行系統(tǒng)研究。
m6A修飾同時(shí)受到多種蛋白的調(diào)控，這些蛋白可以分為3類，分別是添加甲基化修飾的書寫蛋白（writer protein）, 去除甲基化修飾的擦除蛋白（Eraser protein）, 以及識(shí)別、結(jié)合甲基化修飾的閱讀蛋白（reader protein）。Writer protein是甲基轉(zhuǎn)移酶，如WTAP、METTL3、METTL14等；Eraser protein是去甲基化酶，如FTO、ALKBH5等；Reader protein包括一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，如ELAVL1，YTHDF1/2/3等。
m6A 修飾可以調(diào)控mRNA剪接、RNA編輯、影響RNA降解速率、RNA翻譯速率等等，在胚胎發(fā)育、脂肪形成、疾病發(fā)生發(fā)展等眾多生物學(xué)過程中發(fā)揮調(diào)控作用。
m5C
5-甲基胞嘧啶（5-Methylcytosine，m5C），在RNA中廣泛分布，早在上世紀(jì)70年代就已發(fā)現(xiàn)存在于mRNA上。當(dāng)時(shí)由于技術(shù)的局限性，一直未能充分研究。近期研究發(fā)現(xiàn)mRNA m5C在哺乳動(dòng)物中的分布十分保守，在不同組織中修飾的基因具有特異性。
m7G
N7-甲基鳥苷（N7-methylguanosine，m7G）是真核生物tRNA、rRNA和mRNA 5'cap中最豐富的修飾之一。作為一種重要的表觀遺傳修飾，m7G RNA甲基化在基因表達(dá)、加工代謝、蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定等方面發(fā)揮著重要的作用，參與疾病發(fā)生發(fā)展等多種生命過程。
第二部分：技術(shù)原理和技術(shù)流程
技術(shù)原理：
meRIP（methylation-modified RNA Immunoprecipitation Assay），甲基化RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的基本原理是從樣本中抽提RNA，對(duì)RNA進(jìn)行片段化。然后每個(gè)樣品一分為三，一部分片段用針對(duì)該修飾的特異性抗體與RNA片段進(jìn)行免疫沉淀(IP)，留為IP樣品，另一部分用陰性對(duì)照抗體normal IgG來免疫沉淀，最后一部分不進(jìn)行IP直接留作Input樣品。下游可以進(jìn)行RT-PCR分析和RNA-Sequence測序。
技術(shù)流程：
根據(jù)研究目的的不同，采用2種略有不同的技術(shù)流程
MeRIP-PCR既可對(duì)完整的m6A轉(zhuǎn)錄本（Intact）進(jìn)行檢測，也可對(duì)該轉(zhuǎn)錄本的m6A修飾區(qū)域（m6A-deposited Fragments）進(jìn)行檢測。
先打斷RNA再IP
下游熒光定量PCR中是片段化的RNA對(duì)應(yīng)的cDNA片段（200nt左右），需要設(shè)計(jì)甲基化位點(diǎn)特異性的引物進(jìn)行qPCR
下游sequence測序時(shí)的插入片段也是短的cDNA片段（100nt左右）
優(yōu)勢(shì)：
可以大致確定甲基化位點(diǎn)所在的區(qū)域，精確到100-200nt的范圍。
劣勢(shì)：
1、在熒光定量PCR時(shí)需要準(zhǔn)確預(yù)測可能的修飾區(qū)域，才能把引物設(shè)計(jì)好，如果預(yù)測的區(qū)域有誤，那么設(shè)計(jì)的引物將無法進(jìn)行PCR，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
2、在sequence測序時(shí)無法得到整條RNA的序列信息，得到的只能是甲基化位點(diǎn)周圍的100nt的序列信息，對(duì)于發(fā)現(xiàn)未知RNA不利。
先不打斷RNA，通過IP把整條RNA完整免疫沉淀下來
熒光定量PCR中是完整的cDNA，不需要設(shè)計(jì)甲基化位點(diǎn)特異性的引物進(jìn)行qPCR，只需要引物落在整條cDNA上就可以了。
Sequence測序時(shí)的插入片段是短的cDNA片段（100nt左右，建庫時(shí)打斷的）
優(yōu)勢(shì)：
1、熒光定量PCR時(shí)設(shè)計(jì)引物比較簡單，只要是這條RNA上的引物都可以，無需為了設(shè)計(jì)位點(diǎn)特異性的引物去預(yù)測可能的甲基化位點(diǎn)。
2、測序時(shí)可以得到整條RNA的堿基序列信息，對(duì)于未知RNA的發(fā)現(xiàn)是特別有用的。
劣勢(shì)：
不能確定甲基化位點(diǎn)所在的區(qū)域，只能定性定量這條RNA上有甲基化，至于在哪個(gè)具體位點(diǎn)，無法得知。
本試劑盒采用先片段化RNA，隨后IP的技術(shù)流程:
本試劑盒采用的meRIP實(shí)驗(yàn)流程
meRIP實(shí)驗(yàn)中IP得到的片段在測序后與外顯子的比對(duì)組裝
第四部分：meRIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果與示例展示
結(jié)果示例，如下列圖片所示：
m 6 A induced the upregulation of LINC00958 in BC cells. A MeRIP-Seq analysis
revealed a notable m 6 A modification site at the LINC00958 location. B RT-PCR indicated upregulated METTL3 mRNA expression in the BC cell line (MCF-7). C METTL3 knockdown (sh-METTL3) was transfected into MCF-7 cells to silence METTL3 expression. D M 6 A analysis (colorimetric method) presented m 6 A modification enrichment in sh-METTL3 or sh-NC transfection. E MeRIP-qPCR illustrated the m 6 A-modified LINC00958 level after METTL3 silencing or control. F RNA stability analysis demonstrated the LINC00958 level in MCF-7 cells transfected with METTL3 silencing. **p < 0.01 was considered as significant.
第五部分：磁珠法meRIP試劑盒組分清單
（共計(jì)23個(gè)組分，均可單獨(dú)購買）
| 編號(hào) | 組分名稱 | 數(shù)量 | 保存 | 注意 |
| 下列組分收到后需儲(chǔ)存在 4 °C中，磁珠千萬不要冷凍。 |
| meRIP-001 | meRIP級(jí)Protein A/G 磁珠
(核酸預(yù)包被，非特異性RNA結(jié)合極其低) | 1 mL | +4 °C | 不能冷凍
不能高速離心 |
| meRIP-002 | 磁珠洗滌液 | 50 mL | +4 °C |
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| meRIP-003 | 磁珠-抗體結(jié)合反應(yīng)液 | 5 mL | +4 °C |
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| meRIP-004 | 10× RNA Fragmentation Buffer | 0.5 mL | +4 °C |
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| meRIP-005 | Stop Buffer | 0.5 mL | +4 °C |
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| meRIP-007 | meRIP Wash Buffer 1 | 15 mL | +4 °C |
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| meRIP-008 | meRIP Wash Buffer 2 | 15 mL | +4 °C |
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| meRIP-009 | meRIP Elution Buffer | 4 mL | +4 °C | 如有絮狀物，使用前需要置室溫恢復(fù)溶解 |
| 下列組分收到后必須要儲(chǔ)存在 -20 °C中 |
| meRIP-017 | m6A MeRIP Primers Human EEF1A1 Positive陽性對(duì)照引物對(duì)
F: CGG TCT CAG AAC TGT TTG TTT C
R: AAA CCA AAG TGG TCC ACA AA |
| -20 °C |
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| meRIP-018 | m6A MeRIP Primers Human EEF1A1 Negative陰性對(duì)照引物對(duì)
F: GGA TGG AAA GTC ACC CGT AAG
R: TTG TCA GTT GGA CGA GTT GG |
| -20 °C |
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| meRIP-019 | RNase抑制劑 | 100 μL | -20 °C |
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| meRIP-020 | 蛋白酶K | 100 μL | -20 °C |
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| meRIP-021 | RIP級(jí)Normal Mouse IgG陰性對(duì)照 | 100 μL | -20 °C |
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| meRIP-022 | RIP級(jí)Normal Rabbit IgG陰性對(duì)照 | 100 μL | -20 °C |
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| meRIP-023 | RNA級(jí)助沉劑 | 100 μL | -20 °C |
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| meRIP-006 | RNA沉淀緩沖液 | 1.5 mL | -20 °C |
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關(guān)鍵字： RNA甲基化;meRIP;m5C;m6A;m7G;
復(fù)名表觀遺傳學(xué)（上海復(fù)名醫(yī)療科技有限公司），專注于表觀遺傳學(xué)研究工具的開發(fā)和表觀技術(shù)服務(wù)的提供。
經(jīng)過多年和全球著名大學(xué)表觀研究領(lǐng)域?qū)＜医淌诘慕涣骱吞接懀e累經(jīng)驗(yàn)，精準(zhǔn)解決表觀研究工具領(lǐng)域的痛點(diǎn)難點(diǎn)，在表觀基因組學(xué)、表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀蛋白組學(xué)領(lǐng)域均開發(fā)了一系列研究試劑盒并提供表觀技術(shù)服務(wù)，和哈佛大學(xué)，華盛頓大學(xué)，斯坦福大學(xué)，麻省理工學(xué)院，UCSC，UCSF，HHMI，德國海德堡大學(xué)，法國國家健康與醫(yī)學(xué)研究院inserm等世界名校均建立了密切的合作和交流，所開發(fā)的抗體，試劑，試劑盒受到了全球客戶的歡迎。
Engibody為復(fù)名表觀遺傳學(xué)旗下品牌，所開發(fā)的抗體，試劑，表觀試劑盒在全球范圍內(nèi)銷售，受到眾多世界著名大學(xué)課題組老師及醫(yī)藥500強(qiáng)巨頭的認(rèn)可和喜愛。
公司地址: 上海市嘉定區(qū)嘉定工業(yè)區(qū)永盛路1218號(hào)金元大廈908室。
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