中文名：mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase
英文名：mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase
純度：醫(yī)藥級
貨號：C406452
包裝：2.5ku
存儲溫度：-20°C儲存
產(chǎn)品介紹：
產(chǎn)品基本信息
來源：攜帶牛痘病毒mRNA帽結(jié)構(gòu)2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的E.coli菌株。
反應(yīng)條件：1× Capping Reaction Buffer (50 mM Tnis-HC1, pH 8.0; 5 mMKCl; 1 mMMgCl; 1 mM DTT),37C孵育
儲存緩沖液：20mM Tnis-HCl pH8.0;100mMNaC1; 1mMDTT;0.1mM EDTA;0.1%TritonX-100; 50%(vv)Glycerol
產(chǎn)品描述
體外轉(zhuǎn)錄獲得的mRNA未經(jīng)細胞內(nèi)一系列修飾，不具備Cap 結(jié)構(gòu)與PolyA 尾，容易降解，易激活免疫反應(yīng)，不能與核糖體起始蛋白結(jié)合，無法啟動蛋白翻譯，因而在工業(yè)化mRNA生產(chǎn)中，需使用牛痘病毒加帽酶對IVT 的mRNA進行加帽修飾，使mRNA的5' 端獲得Cap0 結(jié)構(gòu)，進一步使用2'-O- 甲基轉(zhuǎn)移酶將Cap0 轉(zhuǎn)化為Cap1。酶法加帽引入的帽結(jié)構(gòu)與真核生物體內(nèi)天然帽結(jié)構(gòu)完全一致，從根本上降低外源mRNA 免疫原性的同時，保護其不被降解，并提高翻譯效率，增加細胞內(nèi)蛋白產(chǎn)量。通過酶法加帽最大可獲得100%的加帽效率，而通過化學(xué)合成帽類似物結(jié)構(gòu)加帽，其加帽效率相對較低，并且帽類似物結(jié)構(gòu)與天然帽結(jié)構(gòu)有差異。
mRNA Cap 2′-O-Methyltransferas 可利用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體， 在 RNA 5′末端緊鄰帽結(jié)構(gòu)（Cap 0）的第一個核苷酸的 2′-O 上添加甲基基團，形成帶有 Cap 1 結(jié)構(gòu)的 mRNA。Cap1 結(jié)構(gòu)能增強 mRNA 的翻譯效率，從而可提高轉(zhuǎn)染后 mRNA 編碼的蛋白表達水平。該酶只能以帶 7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)（m7GpppN）的 RNA 為底物，不會作用于 5′末端為pN、ppN、 pppN 或 GpppN 的 RNA。帶 7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)（m7GpppN）的 RNA 可通過 Vaccinia Capping System（Cat. No: GMP-M062, Novoprotein）來制備。?
本制品利用大腸桿菌大規(guī)模發(fā)酵表達，采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn)，并嚴格控制宿主蛋白質(zhì)殘留、核酸殘留等，符合 GMP 規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程保障生產(chǎn)過程及所有原輔料可追溯。?
圖1. mRNA 帽結(jié)構(gòu) 2′ -O-甲基轉(zhuǎn)移酶作用機理。mRNA 的帽結(jié)構(gòu)是由一個7-甲基鳥苷通過一個5′–5′三磷酸酯橋連接到mRNA 鏈的5′核苷上組成。Cap-0 結(jié)構(gòu)由相鄰的RNA 鏈通過三種酶的依次反應(yīng)形成。進一步形成cap-1 結(jié)構(gòu)需要2′O 甲基轉(zhuǎn)移酶的參與，該修飾可以降低RNA 在體內(nèi)引起的細胞先天免疫反應(yīng)。本圖引自Decroly, E., Ferron, F., Lescar, J. et al. (2012). Conventional and unconventional mechanisms for capping viral mRNA. Nat Rev Microbiol 10, 51-65?
質(zhì)量要求
| 項目 |
標準 |
方法 |
| 外觀 |
澄明液體 |
目視檢查 |
| 可見異物 |
符合規(guī)定 |
中國藥典2020版第四部第一法燈檢法(通則0904) |
| pH值 |
7.5-8.5 |
中國藥典2020版第四部pH值測定法(通則0631) |
| 活性 |
49KUml-51KU/ml |
加帽修飾與效率測定法 |
| 純度 |
≥95% |
中國藥典2020版第四部高效液相色譜法(通則0512) |
| 核酸內(nèi)切酶殘留 |
004-DNA的降解不超過10% |
50U酶與004-DNA.37℃孵育3h |
| 核酸外切酶殘留 |
019 HindITI DNA的降解不超過10% |
50U酶與019 HindIII DNA.37℃孵育3h |
| RNA酶殘留 |
293-RNA的降解不超過10% |
50U酶與293-RNA. 37℃孵育1h |
| 細曲內(nèi)毒素含量 |
≤10 EU/mg |
中國藥典2020版第四部凝膠限度試驗法(通則1143) |
| 外源性DNA殘留 |
≤100 pg/mg |
熒光定量PCR法 |
| 宿主蛋白殘留 |
≤50 ppm |
中國藥典2020版第四部菌體蛋白殘留量測定法(通則3412) |
| 支原體檢測 |
陰性 |
支原體檢測試劑盒 |
| 重金屬殘留 |
≤10 ppm |
中國藥典2020版第四部車金屬檢査法（通則0821） |
|
遵循以下規(guī)范生產(chǎn)
1. ISO 9001:2015, certified facility。
2.《GMP 附錄-細胞治療產(chǎn)品》國家藥品監(jiān)督管理局。
3.《人用基因治療總論-中國藥典 2020》國家藥典委。
4. USP Chapter <1043>, Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于細胞治療，基因治療和組織工程產(chǎn)品中的輔料。
5. USP Chapter <92>, Growth Factors and Cytokines Used in Cell Therapy Manufacturing 細胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)過程中細胞因子和生長因子。
6. Ph. Eur. General Chapter 5.2.12, Raw Materials of Biological Origin for the Production of Cell-based and Gene Therapy Medicinal Products 用于生產(chǎn)細胞或基因治療藥物的生物來源原料。
產(chǎn)品用途
Cap0 結(jié)構(gòu)的 mRNA 2′-O 甲基化（Cap1），以提高 mRNA 的翻譯和表達效率。
應(yīng)用實例
完整mRNA在細胞內(nèi)表達GFP蛋白，加帽酶與帽類似物對比
注意事項
1. 用于反應(yīng)的 RNA 在使用之前應(yīng)進行純化并溶解于 RNase-free water。溶液中不能含有 EDTA 和鹽；
2. 在配置反應(yīng)體系時，建議使用 RNase 抑制劑以增強反應(yīng)中 RNA 的穩(wěn)定性?？梢约尤?0.5μl 的 RNase 抑制劑（Cat. No: GMP-E125, Novoprotein），同時去掉等體積的 RNase-free water；
3. 反應(yīng)之前加熱 RNA 可以去除 5′端的二級結(jié)構(gòu)。如果轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的 5′端結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可以把加熱時間延長至 10 分鐘；
4. SAM 在 pH 7–8, 37°C 條件下不穩(wěn)定，需要在反應(yīng)開始之前新鮮配置。可事先計算好 SAM 的用量，在反應(yīng)開始前將 32 mM的儲備液稀釋成 4 mM 的工作液。為避免 SAM 降解，該工作液需要保存于冰上。
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