T 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（有酚紅/無(wú)酚紅）
一、產(chǎn)品基本信息
產(chǎn)品名稱(chēng) | Applied Cell? T 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（有酚紅/無(wú)酚紅） |
貨 號(hào) | AC-1001035/AC-1001035PRF |
規(guī) 格 | 1000mL（Without IL-2） |
保存條件 | 2-8℃保存，打開(kāi)包裝后，2-3 周內(nèi)使用完畢 |
保質(zhì)期 | 12 個(gè)月 |
二、產(chǎn)品簡(jiǎn)介
T 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基是埃澤思生物（Applied Cell?）一款用于人體外周血來(lái)源 T 細(xì)胞擴(kuò)增的無(wú)血清培養(yǎng)基。外周血 T 淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)是一項(xiàng)重要的免疫學(xué)研究和臨床應(yīng)用技術(shù)，擴(kuò)增和活化血液淋巴細(xì)胞T 細(xì)胞可用于癌癥患者的免疫治療。本產(chǎn)品無(wú)動(dòng)物源成分，未添加IL-2 等細(xì)胞因子，具體使用方法如下所示。
三、材料
? 重組人白細(xì)胞介素 2/IL-2 GMP Grade(Applied Cell?: AC-1001100)
? 抗人 CD3 單克隆抗體(OKT3)/ CD3 單克隆抗體(Applied Cell?: AC-1001101)
?磷酸鹽緩沖液（Applied Cell?: AC-1001037）
? 淋巴細(xì)胞分離液（Applied Cell?: AC-1001030）
?熱滅活的自體人血清或血漿，通過(guò)離心自體血液制備
? 細(xì)胞培養(yǎng)瓶
?一次性注射器（50mL）
? 生理鹽水
四、操作方法(以下步驟皆應(yīng)在無(wú)菌條件下操作)
4-1 包被培養(yǎng)瓶
1) 向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入 10-15mL 抗 CD3 抗體(CD3 單克隆抗體/抗人 CD3 抗體)溶液(用磷酸鹽緩沖液稀釋至 5mg/mL)。
2) 輕輕搖動(dòng)燒瓶，將抗體溶液涂在整個(gè)表面。
3) 在室溫下放置 1 小時(shí)或在冰箱中放置過(guò)夜。
4) 吸出并移除溶液，然后用 10 mL 緩沖液清洗 1 次。
5) 處理過(guò)的培養(yǎng)瓶應(yīng)立即使用或儲(chǔ)存在冰箱中不超過(guò)一周時(shí)間。
*通過(guò)這種處理，培養(yǎng)瓶的表面變成親水性的，并且液體容易在表面上散布。
4-2 淋巴細(xì)胞和血漿的收集
1) 外周血淋巴細(xì)胞制備：使用淋巴細(xì)胞分離液通過(guò)密度梯度離心法從 25ml 肝素化的外周血中分離外周血淋巴細(xì)胞。
2) 用移液管收集上層血漿，倒入滅菌試管中，用于制備自體熱滅活血漿。
3) 小心地將中間白細(xì)胞層收集到離心管中，并用緩沖液稀釋 3 倍以上，并用于 4-4 步驟使用。
4-3 滅活血漿制備
1). 用移液管小心地將上層血漿收集到無(wú)菌離心管中。
2). 在 56℃下加熱 30 分鐘。
3). 在室溫下 1,200xg 離心 10 分鐘。
4). 用移液管將上清血漿收集到無(wú)菌容器中，并儲(chǔ)存在-20--80℃保存。
4-4 外周血單核細(xì)胞(PBMC)制備
1). 使用移液管將第二層的單核細(xì)胞收集到無(wú)菌離心容器中。
2). 用緩沖液稀釋 2 倍以上，在室溫，500G 離心 5 分鐘，沉淀細(xì)胞。
3). 吸掉上清液。
4). 用緩沖液洗滌細(xì)胞，并通過(guò)以 500xg 離心 5 分鐘沉淀細(xì)胞。
5). 去除上清液。
4-5 T 淋巴細(xì)胞的初始培養(yǎng) （day0-day3-day5）
1). 用含有 700 IU/ml IL-2 和 10%熱滅活血漿的 50mL ACM-T 培養(yǎng)基以約 1x106 細(xì)胞/ml 的細(xì)胞密度重懸 PBMC。
2). 將細(xì)胞懸浮液接種到包被好的培養(yǎng)瓶中(50mL/T-225 培養(yǎng)瓶)。
3). 在 37℃的 5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3 天。
4). 培養(yǎng) 3 天后，在培養(yǎng)瓶中加入 50ml 含 700IU/mL IL-2 的 ACM-T Medium，繼續(xù)培養(yǎng)。
5). 培養(yǎng) 2 天后，擴(kuò)增至 3 個(gè)培養(yǎng)瓶，并在每個(gè)培養(yǎng)瓶中補(bǔ)充加入 70ml ACM-T Medium(添加 700 IU/ml IL-2，無(wú)需添加血漿)。
4-6 培養(yǎng)袋擴(kuò)增培養(yǎng) (day5-day8-day12)
1). 在培養(yǎng)后 3 天后，將以上 3 瓶細(xì)胞懸液收集，并轉(zhuǎn)移到 1 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)袋中，同時(shí)需加入額外加入
700 -1000mLACM-T Medium（添加 175 IU/mL IL-2，無(wú)需添加血漿）。
2). 在培養(yǎng) 4 天后，將以上細(xì)胞平均分配到 2 個(gè)培養(yǎng)袋中，并向每個(gè)袋中加入 500mL ACM-T Medium (添加 175 IU/mL IL-2，無(wú)需添加血漿)。
3). 根據(jù)培養(yǎng)計(jì)劃，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，直到達(dá)到期望的細(xì)胞數(shù)。
4-7 細(xì)胞收獲
1). 在培養(yǎng)后的第 14 至 21 天，將所有細(xì)胞懸液收集到無(wú)菌離心瓶中，并以 500xg 離心 10 分鐘。
2). 用含有 0.1%白蛋白的生理鹽水或緩沖液洗滌細(xì)胞 1-2 次，洗滌后 500xg 離心 10 分鐘收集細(xì)胞，。
3). 用含有 1%人血清白蛋白的注射溶液或生理鹽水重新懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)。
五、培養(yǎng)時(shí)間流程表
天數(shù) | 培養(yǎng)瓶/細(xì)胞培養(yǎng)袋 | 培養(yǎng)瓶/細(xì)胞培養(yǎng)袋 | ACM-T 培養(yǎng)基添加量(mL) | IL-2 單位：IU/mL | 自體血漿添加量 (mL) | 對(duì)應(yīng)流程 |
Day1 | T-225 | 1 | -- | -- | NO | 4-1 |
Day 0 | T-225 | 1 | 50mL | 700 | 5ml | 4-2/4-3/4-4/4-5 |
Day 3 | T-225 | 1 | 50mL | 700 | NO | 4-5 |
Day 5 | T-225 | 3 | 70mL x 3 | 700 | NO | 4-5 |
Day 8 | 培養(yǎng)袋 | 1 | 1000 mL | 175 | NO | 4-6 |
Day 12 | 培養(yǎng)袋 | 2 | 1000 mL | 175 | NO | 4-6 |
Day14 | 培養(yǎng)袋 | 2 |
|
| NO | 4-7 |
關(guān)鍵字： T 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基;外周血 T 淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng);無(wú)血清培養(yǎng)基;T 細(xì)胞;
埃澤思生物總部位于上海，公司取名Applied Cell(應(yīng)用細(xì)胞)，是一家致力于為細(xì)胞治aize 療、再生埃澤思生物總部位于上海，公司取名AppliedCell(應(yīng)用細(xì)胞)，是一家致力于為細(xì)胞治療、再生醫(yī)學(xué)提供核心原料，以及研發(fā)服務(wù)（CRO ）和生物藥委托開(kāi)發(fā)生產(chǎn)服務(wù)（CDMO）的生物科技公司。目前公司產(chǎn)品已經(jīng)涵蓋干細(xì)胞、免疫細(xì)胞治療全流程試劑原料。其中核心產(chǎn)品已經(jīng)完成美國(guó)FDADMF備案以及國(guó)家藥品評(píng)審中心（CDE）藥物原輔料備案，是國(guó)內(nèi)資質(zhì)最為齊全的細(xì)胞治療原料供應(yīng)商之一。目前，公司已與國(guó)內(nèi)6家細(xì)胞治療企業(yè)進(jìn)行細(xì)胞治療一類(lèi)新藥聯(lián)合申報(bào)，一項(xiàng)日本一類(lèi)新藥聯(lián)合申報(bào)。