人脂肪干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（無酚紅）
一、產(chǎn)品基本信息
產(chǎn)品名稱 | Applied Cell ? 人脂肪干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（無酚紅） |
貨 號 | AC-1001042（PRF） |
規(guī) 格 | 基礎(chǔ)培養(yǎng)基450mL，添加劑50mL |
運輸保存條件 | 基礎(chǔ)培養(yǎng)基2-8℃，添加劑-20℃至-80℃；混合后2-8℃ |
使用范圍 | 脂肪組織來源的脂肪干細(xì)胞擴增與傳代培養(yǎng) |
保質(zhì)期 | 12個月 |
二、產(chǎn)品簡介
人脂肪干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基是埃澤思生物（Applied Cell?）自主研發(fā)的一款無外源動物成分的人脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基?？蓱?yīng)用于人脂肪組織來源的人脂肪干細(xì)胞的擴增與傳代培養(yǎng)，并保持其多向分化潛能。本產(chǎn)品內(nèi)毒素水平遠(yuǎn)低于中國藥典標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)過程遵循ISO9001體系,并符合GMP指導(dǎo)原則。
人脂肪干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基主要成分：氨基酸，維生素、無機鹽、白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、微量元素，細(xì)胞因子等。
三、產(chǎn)品特性
l 無外源動物蛋白成分，大大降低各類病毒、霉菌和支原體等的污染風(fēng)險。
l 全程無血清生產(chǎn)，極大降低批次間差異。
l 培養(yǎng)過程無需包被培養(yǎng)板。
l 擴增效率高，24h左右增殖翻倍，節(jié)省培養(yǎng)時間。
l 內(nèi)毒素<0.06EU/ml，遠(yuǎn)低于中國藥典水平。
四、產(chǎn)品內(nèi)容
組分 | 規(guī)格 | 數(shù)量 | 運輸 |
人脂肪干細(xì)胞無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基 | 450mL | 1瓶 | 冰袋 |
人脂肪干細(xì)胞無血清添加劑 | 50mL | 1瓶 | 干冰 |
五、相關(guān)產(chǎn)品
無血清細(xì)胞凍存液（治療級）（Applied Cell?: Cat. no.AC-1001006）
人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Applied Cell?: Cat. no.AC-2001003）
人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Applied Cell?: Cat. no.AC-2001004）
細(xì)胞消化液（Applied Cell?: Cat. no. AC-1001024 ）
六、實驗準(zhǔn)備
人脂肪干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基配制
1. 37℃快速解凍人脂肪干細(xì)胞無血清添加劑，快速溶解時不易破壞添加劑中營養(yǎng)物質(zhì)，時間大致為10min。待添加劑融化后搖勻，分裝或直接按比例添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分裝后添加劑立即儲存于-20℃至-80℃，避免反復(fù)凍融 。
2. 將添加劑以10%比例加入到人脂肪干細(xì)胞無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混勻，即為人脂肪干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（AC-1001042PRF）?；旌虾笈囵B(yǎng)基可在2-8℃ 穩(wěn)定儲存2-3周，不建議使用已配制超過3周的培養(yǎng)基。
3. 人脂肪干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基可直接應(yīng)用于人脂肪組織來源的脂肪干細(xì)胞擴增與傳代培養(yǎng)。
七、操作方法(以下步驟皆應(yīng)在無菌條件下操作)
人脂肪干細(xì)胞的分離方法
1. 清洗脂肪組織提取物
新鮮脂肪組織放入4℃預(yù)冷的臍帶脂肪保存液（AC-1001016）中，并快速運輸?shù)綄嶒炇疫M行細(xì)胞分離，充分的清洗脂肪組織提取物，去掉大部分紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。
1.1. 將約10-20mL的脂肪組織提取物放到一個無菌50mL離心管中;
1.2. 靜置一段時間直到脂肪組織與血液分層；
1.3. 用一個巴氏吸管移走血液；
1.4. 加入相同的體積的含有雙抗的PBS，蓋緊蓋子；
1.5. 劇烈搖晃5-10S
1.6. 將50mL離心管放到臺面上使脂肪組織飄在PBS上面。根據(jù)樣品的不同，這大概需要1-5min。
1.7. 用一個巴氏吸管小心的去除PBS；
1.8. 重復(fù)以上的清洗步驟3次（步驟3.4-3.7）
1.9. 最后一次的清洗液體應(yīng)是清澈的。如果液體仍是紅色的，重復(fù)步驟3.4-3.7再次清洗。
2. 脂肪組織消化
用人脂肪干細(xì)胞分離液（AC-1001013）處理脂肪組織
2.1. 在處理開始前10min,37℃預(yù)熱人類脂肪干細(xì)胞分離液；
2.2. 加入與清洗過的脂肪組織等體積的人類脂肪干細(xì)胞分離液至50mL離心管；
2.3. 劇烈旋轉(zhuǎn)搖動50mL離心管5-10s
2.4. 放到37℃培養(yǎng)箱中搖動孵育1-2h，每15min人工劇烈搖晃5-10s
2.5. 處理結(jié)束后，處理后的脂肪組織應(yīng)呈現(xiàn)粥樣的形態(tài)，(如果消化1h后消化效果不完全，
延長消化時間到2h，具體根據(jù)消化程度確定）。
3. 分離基質(zhì)血管部分
3.1. 將人脂肪干細(xì)胞分離液處理后的脂肪組織室溫200g離心5min，脂肪組織出現(xiàn)分層，參考圖1。
3.2. 用巴氏吸管吸掉上層漂浮的脂肪層和中間液體層。留5mL底部液體,將SVF團留在管底(吸液時要注意，細(xì)胞團是凝膠狀的，貼附不牢，容易被吸掉)。
3.3. 用10mL 人脂肪干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（AC-1001042PRF）重懸細(xì)胞團；
3.4. 室溫300 ×g離心5min；
3.5. 去掉上清，留5mL底部的基質(zhì)細(xì)胞和人脂肪干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基混合液；
3.6. 重復(fù)3.3-3.5步驟；
3.7. 室溫300 ×g 離心5min；
4. 重懸SVF，接種
4.1. 用4mL 人脂肪干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基重懸新鮮分離的細(xì)胞，并計數(shù)；
4.2. 將細(xì)胞接種到培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中，接種的細(xì)胞密度為1×10 個，可接種到1個T25的培養(yǎng)瓶中或6孔板的2個孔中，輕輕搖動使細(xì)胞平均分布到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿表面，置于37℃，5% CO 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4.3. 接種24h后，換液去除未貼壁的細(xì)胞；
4.4. 每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞；
4.5. 細(xì)胞通常需要3-5天變成纖維狀細(xì)胞，并開始分裂；
4.6. 每2天換液，細(xì)胞通常在培養(yǎng)5-7天后達到80-90%匯合度；可以傳代或凍存，此時的細(xì)胞為P0代；
5. 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞傳代
培養(yǎng)5-7天后細(xì)胞達到80-90%匯合度時（參考圖2），可以予以傳代或凍存。
5.1. 吸掉培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用PBS清洗一次，加入適量細(xì)胞消化液（AC-1001024）覆蓋皿底，37℃孵育2-3min，顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離皿/瓶底，停止消化。輕輕敲打皿邊待細(xì)胞呈細(xì)沙狀脫落時迅速加入2倍體積的人脂肪干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打使細(xì)胞脫落下來，并輕輕吹打成單細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集到15mL離心管中。
注意：吹打時不能有氣泡
5.2. 室溫300×g 離心5min；
5.3. 棄上清，加入人類間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，按照1:3-1:6的比例傳代。也可以計數(shù)，接種密度為；
5.4. 2-3×10 /cm 。均勻鋪在培養(yǎng)皿/瓶中，置于37℃，5%CO 條件下培養(yǎng)。
6. 加入與清洗過的脂肪組織等體積的人類脂肪干細(xì)胞分離液
hASC細(xì)胞傳代培養(yǎng)
1. 在顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達到90%，即可傳代。
2. 在超凈臺/安全柜中，吸掉原有培養(yǎng)基，加入PBS溶液清洗一次，加入細(xì)胞消化液（AC-1001024）使之完全覆蓋皿/瓶底。
3. 室溫孵育4-5分鐘或37℃孵育2-4分鐘，顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞脫離皿底即停止消化。
4. 加入消化液2倍體積的人脂肪干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，用移液器輕輕吹打瓶壁上未完全脫離的細(xì)胞，并輕輕吹打混勻，使細(xì)胞完全分散。
5. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，1200rpm離心3 min。
6. 棄上清，加入人脂肪干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，計數(shù)。1：3-1：4比例傳代，或按1-2x104 cells/cm2 傳代，均勻鋪在培養(yǎng)皿/瓶中，置于37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
注意：細(xì)胞傳代所需的時間：2-4天。5代及之前的細(xì)胞，生長速度較快。5代以后的細(xì)胞，生長速度稍緩。
hASC細(xì)胞凍存
1. 細(xì)胞達到90%匯合度， 吸掉原有培養(yǎng)基，PBS清洗一次。
2. 加入細(xì)胞消化液（AC-1001024）使之完全覆蓋皿/瓶底，室溫孵育4-5min或37℃孵育2-4min分鐘，顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞脫離皿底即停止消化。
3. 加入消化液2倍體積的人脂肪干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，用移液槍輕輕吹打瓶壁上未完全脫離的細(xì)胞，并輕輕吹打混勻，使細(xì)胞完全分散。
4. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，1200 rpm離心3 min，吸掉上清。
5. 加入適量無血清細(xì)胞凍存液（治療級）（AC-1001006），調(diào)整細(xì)胞凍存密度在1×106 cells/mL左右，每支凍存管分裝1.5-2ml。
6. 直接放入-80℃，24h后轉(zhuǎn)入液氮中長期保存。
細(xì)胞形態(tài)圖
八、質(zhì)量控制
檢驗項目 Test Catagories | 參考數(shù)據(jù) Reference Data |
外觀 Physical Appearance | 無色液體 Colorless Liquid |
澄清度 Clarity | 澄清 Clear |
pH值 pH Value | 7.0-7.4 |
滲透壓 Osmolality | 270-340 （mosm/KgH2O） |
細(xì)菌內(nèi)毒素 Endotoxin | 小于0.06 EU/ml |
無菌 Sterility | 無菌 Sterility |
支原體 Mycoplasma | 0.11um過濾，支原體試驗為陰性 The mycoplasma test was negative after 0.11um filtration |
細(xì)胞生長試驗 Cell Growth Test | 細(xì)胞為梭形，呈指紋狀或螺旋狀生長 The cells are spindle - shaped, fingerlike or spiral |
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埃澤思生物總部位于上海，公司取名Applied Cell(應(yīng)用細(xì)胞)，是一家致力于為細(xì)胞治aize 療、再生埃澤思生物總部位于上海，公司取名AppliedCell(應(yīng)用細(xì)胞)，是一家致力于為細(xì)胞治療、再生醫(yī)學(xué)提供核心原料，以及研發(fā)服務(wù)（CRO ）和生物藥委托開發(fā)生產(chǎn)服務(wù)（CDMO）的生物科技公司。目前公司產(chǎn)品已經(jīng)涵蓋干細(xì)胞、免疫細(xì)胞治療全流程試劑原料。其中核心產(chǎn)品已經(jīng)完成美國FDADMF備案以及國家藥品評審中心（CDE）藥物原輔料備案，是國內(nèi)資質(zhì)最為齊全的細(xì)胞治療原料供應(yīng)商之一。目前，公司已與國內(nèi)6家細(xì)胞治療企業(yè)進行細(xì)胞治療一類新藥聯(lián)合申報，一項日本一類新藥聯(lián)合申報。