產(chǎn)品簡介
活細菌/死細菌雙染試劑盒（SYTO 9/PI Live/Dead Bacterial Double Stain Kit）是一款方便且操作簡單的試劑盒，利用SYTO 9綠色核酸染料和碘化丙啶（PI）紅色熒光核酸染料來進行細菌活力的檢測，適用于大量的細菌種屬，包括蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、草分枝桿菌、綠膿桿菌、金黃葡萄球菌、奧拉尼堡沙門氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌和化膿性鏈球菌。
本試劑盒的工作原理在于：SYTO 9和PI的光譜特征以及穿透健康細菌細胞的能力不同。單獨使用時，SYTO 9能對群體內(nèi)的所有細菌進行標記—具有完整膜和受損膜的細菌；相反，PI只能滲透進入受損的膜，PI的插入會引起SYTO 9染色熒光的降低，當(dāng)體系內(nèi)加入兩種染料時。因此，通過適量比例的SYTO 9和PI的混合染色，具有完整膜結(jié)構(gòu)的細菌呈綠色熒光，而具受損膜結(jié)構(gòu)的細菌呈紅色熒光。兩者染料的激發(fā)和發(fā)射波長分別是480/500nm（SYTO 9）和 490/635nm（PI）。背景基本無熒光。本試劑盒兼容于熒光顯微鏡，熒光光度計、熒光酶標儀、流式細胞儀或其它熒光檢測儀器。
產(chǎn)品組成
| 編號/組分 | FS4005-40T | 規(guī)格 | 保存方法 |
| FS4005-A | SYTO 9 Solution (3.34mM) | 60μl | -20oC避光 |
| FS4005-B | PI Solution（20mM） | 60μl | -20oC避光 |
| FS4005-C | Mounting oil, for bacteria immobilized on membranes | 2ml | -20oC保存 |
試劑盒規(guī)格說明（按照建議的試劑稀釋倍數(shù)和單次測試體積來計算）：保存與運輸方法:-20℃避光保存，有效期一年。 冰袋運輸。
熒光顯微鏡檢測：1ml菌液加入3μl染料混合液（SYTO 1.5μl +PI 1.5μl），可做40次獨立測試。
熒光酶標儀檢測：2ml無菌水加入12μl染料混合液（SYTO 6.0μl +PI 6.0μl），制備成2×工作液。按照100μl染料混合液加入100μl菌液的比例使用，可做200次獨立測試。
流式細胞儀檢測：2ml菌液加入6μl染料混合液（SYTO 3.0μl +PI 3.0μl），可做20次獨立測試。
使用方法(以下步驟僅用作示例以指導(dǎo)科研人員開展自身細菌樣本的染色。)
一、培養(yǎng)條件和細菌懸液的制備
【注意】：用本試劑盒進行細菌染色，務(wù)必要小心去除培養(yǎng)基殘留，因為，核酸和其它培養(yǎng)基成分可能以不可預(yù)料的方式與SYTO 9和PI結(jié)合，導(dǎo)致染色結(jié)果發(fā)生不可接受的變動。簡單的一次清洗步驟通常足以去除培養(yǎng)基內(nèi)含的培養(yǎng)基成分干擾物殘留。不建議使用磷酸鹽清洗緩沖液，因此可能降低染色效率。
1.1 用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)大腸桿菌或金黃色葡萄球菌（30ml）使其生長至對數(shù)生長后期。
1.2 于10000×g離心10-15min，濃縮25ml細菌培養(yǎng)物。
1.3 吸走上清液，用2ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液來重懸沉淀。
1.4 取1ml重懸菌液分別加入含20ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液的30-40ml離心管（用作活細菌），或含20ml 70%異丙醇的30-40ml離心管（用作殺死細菌）。
1.5 兩管樣品于室溫孵育1h，每隔15min顛倒混勻一次。
1.6 兩管樣品于10000×g離心10-15min。
1.7 用20ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液重懸沉淀，并且按照步驟1.6再離心一次。
1.8 分別用10ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液重懸兩管樣品。
1.9 分別取3ml菌液測定670nm的光密度（OD670），用玻璃或丙烯酸酯比色皿（1cm路徑）。
1.10 對于大腸桿菌或金黃色葡萄球菌的建議染色濃度，根據(jù)你的儀器類型（熒光顯微鏡、熒光光度經(jīng)、熒光酶標儀）或流式細胞儀來參考相應(yīng)部分的染色條件。
二、染色條件的優(yōu)化
試劑盒內(nèi)的兩種染料都經(jīng)過平衡優(yōu)化，按照1：1的比例進行混合用于絕大多數(shù)的樣本都能得到良好的區(qū)分活/死細菌。偶然情況下，兩種染料的混合比例需根據(jù)實際需求進行優(yōu)化調(diào)整。比如：在待檢樣本中，綠色熒光太突出，建議要么降低SYTO 9濃度，要么提高PI濃度。
為了全面優(yōu)化染色條件，建議測試梯度濃度的SYTO 9，每一種濃度與梯度濃度的PI進行組合染色。建議按照1ml細菌懸液加入3μl不同混合比率的染料預(yù)混液。
三、熒光顯微鏡操作步驟
活菌和死菌的熒光可能用標準的熒光素長通濾片設(shè)置來同時觀察。替代方案的話，活菌（綠色熒光）和死菌（紅色熒光）可分別用熒光素和Texas Red帶通濾光片設(shè)置。用于本試劑盒檢測的建議熒光顯微鏡濾片設(shè)置見表1。
表1 適用于本試劑盒檢測用的常見濾光片特征
Omega濾光片* | Chroma濾光片* | 注意事項 |
XF25, XF26, XF115 | 11001, 41012, 71010 | 用于同時觀察SYTO 9和PI染色的長通和雙發(fā)射濾光片 |
XF22, XF23 | 31001, 41001 | 僅用于觀察SYTO 9的帶通濾光片 |
XF32, XF43, XF102, XF108 | 31002, 31004, 41002, 4100 | 僅用于觀察PI的帶通濾光片 |
用于熒光顯微鏡觀察的推薦帶通濾光片。Omega濾光片由Omega Optical提供，Chroma濾光片由Chroma Technolog公司提供。 |
3.1 在微量離心管內(nèi)組合等量的組分A（SYTO 9）和組分B（PI），混勻。
3.2 每1ml細菌懸液內(nèi)加入3μl染料預(yù)混液。按照建議的稀釋倍數(shù)，最終得到的染色工作液內(nèi)含0.3% DMSO。更高濃度的DMSO可能對染色產(chǎn)生副效果。
3.3 混勻后室溫避光孵育15min。
3.4 吸5μl染色的細菌懸液到載玻片上，并蓋上18mm方形蓋玻片。
3.5 根據(jù)表1選擇熒光顯微鏡上合適的濾片來觀察。
四、熒光光度計操作步驟
4.1 調(diào)整大腸桿菌懸液（活和殺死）使其密度為1×108個細菌/ml（~0.03 OD670）或金黃色葡萄球菌懸液（活和殺死）使其密度為1×107個細菌/ml（~0.15 OD670）。用于熒光光度計檢測，金黃色葡萄球菌懸液的濃度通常比大腸桿菌少10倍。
4.2 參考表2在1cm 玻璃、丙烯酸酯或石英熒光比色皿混勻五種不同比例的細菌懸液。每個樣本的總體積為3ml。
表2. 熒光光度計法檢測活/死細菌所需不同比例活細菌和死細菌懸液的加量體積
活：死細菌比例 | ml 活細菌懸液 | ml 死細菌懸液 |
0：100 | 0 | 3.0 |
10：90 | 0.3 | 2.7 |
50：50 | 1.5 | 1.5 |
90：10 | 2.7 | 0.3 |
100：0 | 3.0 | 0 |
4.3 在微量離心管內(nèi)分別加30μl組分A（SYTO 9）和30μl組分B（PI），混勻。
4.4 每組不同比例的細菌懸液內(nèi)加入9μl染料預(yù)混液（5個樣本×9μl =45μl總量），用槍上下吹打數(shù)次使其混勻。
4.5 室溫避光孵育15min。
4.6 熒光測定和數(shù)據(jù)分析
①用熒光光度計測定每組細菌懸液（Fcell）的熒光發(fā)射光譜（激發(fā)：470nm，發(fā)射：490-700nm）；
②分別測定發(fā)射光譜在510-540nm（em1，綠色）和620-650nm（em2，紅色）的累積熒光，并計算累積熒光比值：RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2
③以大腸桿菌懸液內(nèi)活細胞的占比為橫坐標，以累積綠色熒光與紅色熒光比（RatioG/R）為縱坐標，制圖。
五、熒光酶標儀操作步驟
針對細菌懸液，用熒光酶標儀的測定條件與熒光光度計的基本類似。如同熒光光度計的檢測步驟，染料濃度相同于熒光顯微鏡的建議濃度，綠/紅熒光比與活細菌相對數(shù)量呈正比。
5.1 調(diào)整大腸桿菌懸液（活和殺死）使其密度為2×108個細菌/ml（~0.06 OD670）或金黃色葡萄球菌懸液（活和殺死）使其密度為2×107個細菌/ml（~0.3 OD670）。用于熒光酶標儀檢測，金黃色葡萄球菌懸液的濃度通常比大腸桿菌少10倍。
5.2 參考表3在16×125mm高硼硅玻璃培養(yǎng)管內(nèi)混勻五種不同比例的細菌懸液（大腸桿菌或金黃色葡萄球菌）。每個樣本的總體積為2ml。
表3. 熒光酶標儀法檢測活/死細菌所需不同比例活細菌和死細菌懸液的加量體積
活：死細菌比例 | ml 活細菌懸液 | ml 死細菌懸液 |
0：100 | 0 | 2.0 |
10：90 | 0.2 | 1.8 |
50：50 | 1.0 | 1.0 |
90：10 | 1.8 | 0.2 |
100：0 | 2.0 | 0 |
5.3 在微量離心管內(nèi)分別加6μl組分A（SYTO 9）和6μl組分B（PI），混勻。
5.4 通過將所有的12μl上述預(yù)混液加入2ml無菌的dH2O，混勻后制備2×染色混合液。
5.5 吸100μl細菌懸液混合物到平底96孔板的各孔內(nèi)，建議每個制備物做三個平行。96孔板的邊緣孔通常空置以避免假讀數(shù)。
5.6 更換新的槍頭，每孔加入100μl 2×染色混合液，上下吹打使充分混勻。
5.7 室溫避光孵育15min。
5.8 熒光測定和數(shù)據(jù)分析
①以~485nm為激發(fā)波長，~530nm為發(fā)射波長（emission 1，綠色）來測定每孔熒光；
②以~485nm為激發(fā)波長，~630nm為發(fā)射波長（emission 2，紅色）來測定每孔熒光；
③通過測定兩種發(fā)射波長下的熒光強光，并計算熒光比值：RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2
④以大腸桿菌懸液內(nèi)活細胞的占比為橫坐標，以RatioG/R為縱坐標，制圖。
六、流式細胞儀操作步驟
儀器的檢測配置可能要因?qū)嶋H情況來調(diào)整，但此處列出的檢測技術(shù)和設(shè)置參數(shù)適用于市場上絕大多數(shù)流式細胞儀。
6.1 調(diào)整大腸桿菌懸液（活和殺死）使其密度為1×108個細菌/ml（~0.03 OD670），之后用無菌dH2O稀釋100倍使其最終密度為1×106個細菌/ml。
6.2 參考表4在16×125mm高硼硅玻璃培養(yǎng)管內(nèi)混11種不同比例的細菌懸液。每個樣本的總體積為2ml。
表4. 流式細胞儀法檢測活/死細菌所需不同比例活細菌和死細菌懸液的加量體積
活：死細菌比例 | ml 活細菌懸液 | ml 死細菌懸液 |
0：100 | 0 | 2.0 |
10：90 | 0.2 | 1.8 |
20：80 | 0.4 | 1.6 |
30：70 | 0.6 | 1.4 |
40：60 | 0.8 | 1.2 |
50：50 | 1.0 | 1.0 |
60：40 | 1.2 | 0.8 |
70：30 | 1.4 | 0.6 |
80：20 | 1.6 | 0.4 |
90：10 | 1.8 | 0.2 |
100：0 | 2.0 | 0 |
[溫馨提示]：
可參閱文章：Optimization of staining with SYTO 9/propidium iodide: interplay, kinetics and impact on Brevibacill，了解用SYTO 9/PI進行流式分析時參數(shù)設(shè)置的一些注意事項。
注意事項
1) 由于試劑盒內(nèi)SYTO 9和PI的組分量少，室溫回溫充分融化后，務(wù)必低速離心沉至管底后再開蓋。
2) 次使用可將SYTO 9和PI根據(jù)單次用量分裝保存，密封后置于≤-20℃避光保存。
3) 組分C（Mounting oil）用于將細菌固定在膜上，25℃的折射率是517 ± 0.003。不要用作浸油（Immersion oil）。
4) SYTO 9和PI結(jié)合核酸，PI是潛在的誘變劑，目前沒有數(shù)據(jù)闡明SYTO 9的誘變性或毒性，兩種試劑使用都需做恰當(dāng)防護。DMSO能促進有機分子進入組織。強烈建議處理DMSO儲存液時戴雙層手套。對于核酸染料，含此類染料的試劑經(jīng)活性炭吸附后再進行廢液處理?；钚蕴恐蠼?jīng)焚燒來破壞染料。
5) 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
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復(fù)申生物公司服務(wù)全國各地的科研院所、高等院校、衛(wèi)生檢驗檢疫部門、環(huán)境保護部門、制藥、食品、化工等生產(chǎn)企業(yè)終端零售和全國各地經(jīng)銷批發(fā)的。建立了貿(mào)易往來的品牌有等等各大世界知名品牌并且成為多數(shù)生命科學(xué)產(chǎn)品品牌的中國代理商，產(chǎn)品涉及分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、細菌學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)、蛋白質(zhì)學(xué)、細胞治療等領(lǐng)域。