鬼筆環(huán)肽標(biāo)記系列產(chǎn)品

保存：-20℃干燥、避光保存，有效期一年。

若配制成水溶液，請(qǐng)小量分裝保存，避免反復(fù)凍融。

注意：產(chǎn)品系列為凍干粉形式或儲(chǔ)存液形式；

凍干粉使用前請(qǐng)瞬時(shí)離心，加適當(dāng)溶劑溶解后使用；

儲(chǔ)存液形式產(chǎn)品，建議收到產(chǎn)品后，根據(jù)單次使用量，對(duì)母液進(jìn)行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，使用1×PBS 緩沖液稀釋儲(chǔ)存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200nM?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

鬼筆環(huán)肽是從致命的傘形毒蕈蘑菇中分離出來(lái)的一種毒素。它是特異性結(jié)合于F-肌動(dòng)蛋白的雙環(huán)肽。因此用熒光染料標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可以非常方便的研究F-肌動(dòng)蛋白的分布。鬼筆環(huán)肽內(nèi)部，在半胱氨酸和色氨酸之間含有不常見(jiàn)的硫醚橋形成內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)。在pH升高時(shí)，該硫醚被裂解，鬼筆環(huán)肽失去對(duì)肌動(dòng)蛋白的親和力。不同于抗體，鬼筆環(huán)肽與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合親和力在不同物種間沒(méi)有顯著變化。非特異性染色可以忽略不計(jì)，染色和未染色區(qū)域之間的對(duì)比度非常大。鬼筆環(huán)肽將單體/聚合物的平衡轉(zhuǎn)向聚合狀態(tài)，將聚合臨界濃度降低至30倍。

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熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可在納摩爾水平染色F-肌動(dòng)蛋白（1-3）。在各種植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞中，標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對(duì)大、小細(xì)絲具有相似的親和力，平均每個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基結(jié)合一個(gè)鬼筆環(huán)肽分子。

TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹明）標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，染色反應(yīng)特異性強(qiáng)，對(duì)比性高，具有比Actin 抗體更好的染色效果，適合用作F-actin 的定性和定量檢測(cè)。另外，經(jīng)本品結(jié)合后的F-actin 仍能維持actin 自身具有的許多生物學(xué)特性。且本品的結(jié)合沒(méi)有物種差異性，適用性廣泛。

FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，染色反應(yīng)特異性強(qiáng)，對(duì)比性高，具有比Actin抗體更好的染色效果，適合用作F-actin的定性和定量檢測(cè)。另外，經(jīng)本品結(jié)合后的F-actin仍能維持actin自身具有的許多生物學(xué)特性。且本品的結(jié)合沒(méi)有物種差異性，適用性廣泛。

實(shí)驗(yàn)圖例: 

圖1  TRITC標(biāo)記 圖2  FITC標(biāo)記

圖3  488標(biāo)記

熒光標(biāo)記操作步驟(僅供參考)：?

1. 儲(chǔ)液制備：

熒光染料標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽：取適量甲醇或無(wú)菌水溶解棕色管中凍干的粉末，制備成200U/mL的儲(chǔ)液（300T規(guī)格染料加入1.5mL的液體）。

熒光標(biāo)記的標(biāo)記鬼筆環(huán)肽的一個(gè)單位（T）的定義是染色一個(gè)加載細(xì)胞的載玻片所用染料的量。使用時(shí)的推薦稀釋比例為1:40-1:200，一個(gè)單位相當(dāng)于200μL總?cè)旧w積中加入1-5μL 200U /mL儲(chǔ)備溶液。

注：稀釋比例可以根據(jù)實(shí)際染色效果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

2. 細(xì)胞染色：

A. 固定細(xì)胞染色

以下方案是針對(duì)生長(zhǎng)在玻璃蓋玻片或8孔室玻片上的貼壁細(xì)胞的染色步驟。鬼筆環(huán)肽也可用于染色固定的冷凍或石蠟組織切片。

1. 用PBS清洗細(xì)胞3次。

2. 用含有3.75％甲醛的PBS溶液固定細(xì)胞，冰上固定15 min。

3. 注意：甲醇可以在固定過(guò)程中破壞肌動(dòng)蛋白。因此避免含有任何甲醇的固定劑。優(yōu)選的固定劑是不含甲醇的甲醛。

4. 用PBS清洗細(xì)胞3次。

5. 用含0.5％Triton X-100的PBS溶液在室溫下透化細(xì)胞10 min。

6. 用PBS清洗細(xì)胞3次。

7. 用200μL PBS稀釋1-5μL熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽儲(chǔ)液，加入一個(gè)蓋玻片或孔中，室溫孵育20 min，進(jìn)行染色。

8. 注：染色體積可根據(jù)樣本情況進(jìn)行調(diào)節(jié)。孵育過(guò)程中為避免染液揮發(fā)，可將蓋玻片放于密封容器內(nèi)。

9. 用PBS清洗細(xì)胞2-3次。

10. 熒光顯微鏡觀察。此產(chǎn)品具有很好的光穩(wěn)定，樣品可以在PBS中成像，但為了效果，也可以使用抗熒光淬滅劑觀察。

B. 活細(xì)胞染色

熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽不具有細(xì)胞透性，因此沒(méi)有被廣范用于活細(xì)胞標(biāo)記。然而，有報(bào)道稱(chēng)活細(xì)胞可能通過(guò)胞飲或未知機(jī)制進(jìn)行標(biāo)記。一般來(lái)說(shuō)，染色活細(xì)胞時(shí)需要更多的染料?；蛘邿晒鈽?biāo)記的鬼筆環(huán)肽也可被注入到細(xì)胞中用于監(jiān)測(cè)肌動(dòng)蛋白分布和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。 請(qǐng)查閱參考文獻(xiàn)。

羅丹明/FITC標(biāo)記儲(chǔ)存液形式操作參考：

需要自備材料：

1. （可選）甲醇

2. 1×PBS 緩沖液, pH 7.4,細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別

3. 固定液4%多聚甲醛（溶于PBS 緩沖液）

4. 丙酮或透化液0.5% Triton X-100（溶于PBS 緩沖液）

5. Fluoromount-GTM 水溶性封片劑（不含DAPI），DAPI

6. （可選）DAPI Fluoromount-GTM 水溶性封片劑（含DAPI）

7. （可選）BSA，標(biāo)準(zhǔn)級(jí)別

8. 載玻片和蓋玻片

9. 蓋玻片周?chē)芊庖海ㄈ缤该髦讣子停?/span>

10. 組裝有TRITC 激發(fā)/發(fā)射濾片，以及DAPI 激發(fā)/發(fā)射濾片的熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡。

操作步驟：

1. 工作液準(zhǔn)備

本品以溶于甲醇的20μM 儲(chǔ)存液形式提供，總量為300μl。按照100nM 的工作液濃度來(lái)?yè)Q算，可制備總量為60 ml 的工作液。建議收到產(chǎn)品后，根據(jù)單次使用量，對(duì)母液進(jìn)行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，使用1×PBS 緩沖液稀釋儲(chǔ)存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200nM?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

2. 染色步驟

1） 細(xì)胞爬片生長(zhǎng)24h，使其密度達(dá)到50%匯合度。

2） 吸掉培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的1×PBS（pH 7.4）清洗細(xì)胞2 次。

3） 使用溶于PBS 的4%甲醛溶液進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定10min。

注意：避免固定劑中含有甲醇成分，因?yàn)榧状荚诠潭ㄟ^(guò)程中可能破壞肌動(dòng)蛋白。

4） 室溫條件下，用PBS 清洗細(xì)胞2~3 次，每次10min。

5） 室溫條件下，用丙酮（≤ -20℃）脫水或者用0.5% Triton X-100 溶液透化處理5min。

6） 室溫條件下，用PBS 清洗細(xì)胞2~3 次，每次10min。

7） 取200μl 配制好的TRITC 標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液，覆蓋住蓋玻片上的細(xì)胞，室溫避光孵育30min（通常情況下，4℃~37℃孵育皆可）。

注意：為了降低背景，可于TRITC 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液內(nèi)加入1% BSA；另外，孵育過(guò)程中為了避免溶液揮發(fā)，可將蓋玻片轉(zhuǎn)移到一個(gè)密封的容器內(nèi)。

8） 用PBS 清洗蓋玻片3 次，每次5min。

9） 使用200μl DAPI 溶液（濃度：100nM）對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，約30s。

10) 用PBS 清洗蓋玻片，然后倒置在已經(jīng)滴有一滴Fluoromount-GTM 水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封片劑，然后用指甲油永久封片。此法制備的標(biāo)本玻片可置于4℃避光保存，通常6 個(gè)月內(nèi)可繼續(xù)做F-actin 染色分析。

注意：也可以直接使用含有DAPI 的抗熒光淬滅封片劑合并步驟9）10），簡(jiǎn)化步驟。

11) 熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察，自行選擇合適TRITC 激發(fā)/發(fā)射濾片和DAPI 激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。

注意事項(xiàng)：產(chǎn)品非質(zhì)量問(wèn)題（產(chǎn)品批次間會(huì)存在細(xì)微的差異，例如顏色、性狀等）可在訂貨日起一個(gè)月內(nèi)無(wú)理由退換；質(zhì)量問(wèn)題處理原則以產(chǎn)品本身價(jià)值為限，不承擔(dān)其他連帶責(zé)任。