PCR試劑盒cccDNA染料檢測(cè)試劑盒組份：

表 1：試劑盒組份

規(guī)格 ：100  反應(yīng)

適用機(jī)型：

PRISM 7500 Real-Time PCR System (ABI)

StepOne Plus Real-Time PCR System (ABI)

LightCycler 480 (Roche)

AriaMX (Agilent Technologies)

CFX (BIO-RAD)

實(shí)驗(yàn)所需但試劑盒未包含材料：

? 1.5ml 無(wú)菌低吸附離心管

? 96 孔 qPCR  板

? 一次性手套

? 1000ul 、100ul 、10ul 無(wú)菌低吸附帶濾芯移液槍頭

相關(guān)設(shè)備：

?  離心機(jī)

? 渦旋振蕩器

? 熒光定量 PCR 儀

? 1000ul 、100ul 、10ul 移液器

實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程：

一、 CHO DNA 定量參考品的稀釋及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用試劑盒中提供的 DNA dilution buffer 將 CHO control DNA 進(jìn)行梯度稀釋， 稀釋濃度依 次為 300pg/ul 、30pg/ul 、3pg/ul 、300fg/ul 、30fg/ul 、3fg/ul 。具體操作如下：

1.將試劑盒中的 CHO control DNA 和 DNA dilution buffer 置于冰上融化，待完全融化后，

輕微振蕩混勻，簡(jiǎn)短快速離心。

2.取 6 支干凈的 1.5ml 離心管，分別標(biāo)記為 SD1 ，SD2 ，SD3 ，SD4 ，SD5, SD6。

3，SD1 管中加入 198ul DNA dilution buffer，其余管中分別加入 180ul DNA dilution buffer。

4,取 2ul  CHO  control  DNA 加入 SD1 管中，  然后渦旋振蕩混勻 5- 10s 后短時(shí)快速離心 5s，渦旋振蕩和快速離心各重復(fù) 3 次。

5,按表 2 依次進(jìn)行 6 次梯度稀釋操作，稀釋操作同步驟 4。

表 2. CHO control DNA 的稀釋

二、加樣回收質(zhì)控 ERC 的制備

根據(jù)待測(cè)樣本的殘留量設(shè)置 ERC 中 CHO  control  DNA 的加樣濃度  (以制備加 45pg  CHO control DNA 的樣本 ERC 為例)，操作如下：

1，取待測(cè)樣本 100u，加至 1.5ml 干凈的離心管中；

2，加入 1.5ul SD2，混勻，標(biāo)記為樣本 ERC。

注：樣本 ERC 和同批待測(cè)樣本需一起進(jìn)行樣本前處理。

三、陰性質(zhì)控 NEG 的制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性質(zhì)控，操作如下：

1，取 100ul 樣本基質(zhì)溶液(或洗脫液)加至 1.5ml 干凈的離心管中標(biāo)記為陰性質(zhì)控 NEG。 注：陰性質(zhì)控 NEG 樣本和同批待測(cè)樣本需一起進(jìn)行樣本前處理。

四、 qPCR 反應(yīng)液的制備和加樣

1，根據(jù)所要檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣本數(shù)量，計(jì)算所需反應(yīng)孔數(shù)，一般做 3 個(gè)重復(fù)孔/樣。

反應(yīng)孔數(shù)=  (6 個(gè)濃度梯度+1 個(gè)無(wú)模板對(duì)照 NTC+1 個(gè)陰性質(zhì)控 NEG+待測(cè)樣本×2) ×3 注：待測(cè)樣本×2 是為了讓每個(gè)待測(cè)樣本檢測(cè)時(shí)都同時(shí)做樣本 ERC 。                  2，根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算本次實(shí)驗(yàn)所需的各組分的所需總量以制備 pre-mix：

2×Taqman master mix=(反應(yīng)孔數(shù)+2) ×15ul    (含有 2 孔的損失量)

10×CHO qPCR mix=  (反應(yīng)孔數(shù)+2) ×3ul

RNase-free H2O=  (反應(yīng)孔數(shù)+2) ×2ul

3，各試劑置于冰上融化，振蕩混勻，按表 3 所示進(jìn)行加樣：

表 3.各反應(yīng)孔加樣示例

注：加樣完成后每孔總體積為 30ul。

表 4. 96 孔板排版示例

注：該表示例的是檢測(cè) 6 個(gè)濃度梯度的 CHO  control  DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線(SD1-SD6) 、1 個(gè)無(wú)模 板對(duì)照 NTC、1 個(gè)陰性質(zhì)控 NEG、3 個(gè)待測(cè)樣本(S1-S3)和每個(gè)樣本的 ERC(S1 ERC-S3 ERC)。 每個(gè)檢測(cè)做 3 個(gè)重復(fù)孔。

4.  將 96 孔板用光學(xué)膜封閉，輕微振蕩混勻，短時(shí)間快速離心后放入 qPCR 儀中。

PCR試劑盒cccDNA染料檢測(cè)qPCR 程序參數(shù)設(shè)置(以 ABI 7500 為例)：

1.創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對(duì)定量檢測(cè)模塊。

2.創(chuàng)建新檢測(cè)探針，命名為 CHO-DNA，選擇報(bào)告熒光基團(tuán)為 FAM，淬滅基團(tuán)為 none,檢測(cè) 參比熒光為 ROX。

3.設(shè)置兩步法反應(yīng)程序： 95oC 預(yù)變性 10min；95oC 10 sec，60oC 1min，40 個(gè)循環(huán)； 反應(yīng)體積為 30ul。

qPCR 結(jié)果分析(以 ABI 7500 為例)

1.在 Results 的 Amplification  plot 面板中， 將 Threshold 設(shè)置為 0.05 ，點(diǎn)擊 Analyze，此時(shí)可 初步查看擴(kuò)增曲線的形態(tài)是否正常。

2.在 Results  的 Plate 面板中，將標(biāo)準(zhǔn)曲線孔的 Task 一欄設(shè)置為 Standard，并且在 Quantity 一欄分別賦值為 3000 、300 、30 、3 、0.3 、0.03  (含義為每孔的 DNA 量， 單位為 pg)， 并且

在相應(yīng)的 Sample Name 一欄命名為 SD1 、SD2 、SD3 、SD4 、SD5 、SD6。

3.在 Results 的 Plate 面板中，將無(wú)模板對(duì)照 NTC 孔的 Task 一欄設(shè)置為 NTC，將陰性質(zhì)控 NEG 孔、待測(cè)樣本孔、樣本 ERC 孔的 Task 一欄設(shè)置為 Unknown，并且在相應(yīng)的 Sample Name 一欄中命名為 NTC 、NEG 、S 、ERC ，之后點(diǎn)擊開始鍵。

4.在 Results 的 Standard Curve  面板中，可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(Slope)、截距(Intercept)、R² 。

5.在 Results 的 Report 面板中， Mean Quantity 一欄可讀取無(wú)末班對(duì)照 NTC、陰性質(zhì)控 NEG、 待測(cè)樣本、樣本 ERC 的檢測(cè)值。后續(xù)可在檢測(cè)報(bào)告中將單位換算為 pg/ml  樣本。

注:根據(jù)待測(cè)樣本和樣本 ERC 的檢測(cè)結(jié)果計(jì)算加樣回收率，加樣回收率要求在 50%- 150%之 間。