線粒體檸檬酸（Mitochondrion citric acid, MCA）含量試劑盒說明書
分光光度法25管/24樣
注 意：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
線粒體檸檬酸（Mitochondrion citric acid, MCA）含量試劑盒測定意義：
CA是線粒體三羧酸循環(huán)的個中間產(chǎn)物，由檸檬酸合酶催化乙酰CoA與草酰乙酸合成，其含量是三羧酸循環(huán)強(qiáng)度的主要指標(biāo)之一。
配合測定丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性、乙酰CoA含量、檸檬酸合酶活性和CA含量，其中（1）丙酮酸含量和丙酮酸脫氫酶活性變化可以反映糖酵解進(jìn)行程度，（2）綜合分析丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性和乙酰CoA含量變化可以反映脂肪酸β-氧化途徑提供的乙酰CoA情況，（3）乙酰CoA含量、檸檬酸合酶活性和CA含量變化可以反映三羧酸循環(huán)進(jìn)行狀況。
測定原理：
CA在檸檬酸裂解酶的作用下，生成α-酮酸（草酰乙酸）；在弱酸性條件下，α-酮酸進(jìn)一步與苯肼反應(yīng)，生成相應(yīng)的α-酮酸苯腙；α-酮酸苯腙在330nm處有吸收峰，該波長下吸光度的變化程度可反映出CA的含量。
自備儀器和用品：
分光光度計、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1mL石英比色皿、研缽和蒸餾水。
試劑組成和配制：
酸性提取液：液體25mL×1瓶，4℃保存。
堿性提取液：液體25mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體7.5mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體2.5mL×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入7.5mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑4℃保存；
標(biāo)準(zhǔn)品：液體1mL×1支，10μmol/mL檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。
線粒體檸檬酸（Mitochondrion citric acid, MCA）含量試劑盒線粒體中檸檬酸提取：
稱0.05~0.1g樣品（建議稱0.1g樣本），加入0.5mL酸性提取液，冰上充分研磨，600g/min 4℃離心5min；取上清至另一EP管中，11000g/min 4℃離心10min，棄上清（取300μL該上清液和300μL堿性提取液中和后可用于細(xì)胞質(zhì)CA含量測定）；沉淀即線粒體，向沉淀中加入0.5mL酸性提取液，充分懸浮溶解，超聲波破碎（功率20％，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），取此溶液300μL和300μL堿性提取液中和，混勻，置冰上待測（不可用于蛋白質(zhì)含量測定）。
測定步驟：
1、分光光度計預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長到330nm，蒸餾水調(diào)零。
2、試劑一、二和三37℃預(yù)熱10min。
3、樣本測定：
空白管和標(biāo)準(zhǔn)管通常只需要各做一個。
試劑名稱(μL) | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 測定管 |
試劑一 | 300 | 300 | 300 |
蒸餾水 | 300 |
|
|
標(biāo)準(zhǔn)液 |
| 300 |
|
樣本 |
|
| 300 |
試劑二 | 100 | 100 | 100 |
試劑三 | 300 | 300 | 300 |
充分混勻，330nm立即測定初始吸光值A1和37℃孵育30min后的吸光值A2，ΔA=A2 –A1。
檸檬酸含量計算：
（1）按蛋白濃度計算
檸檬酸含量(μmol/mg prot)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA測定管－ΔA空白管)÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA空白管) ×V樣]÷（V樣÷Cpr）=10×(ΔA測定管－ΔA空白管)÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA空白管)÷Cpr
蛋白質(zhì)含量需要另外測定。
（2）按樣本鮮重計算
檸檬酸含量(μ mol/g鮮重)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA測定管－ΔA空白管)÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA空白管) ×V樣]÷（W×V樣÷V樣總）=10×(ΔA測定管－ΔA空白管)÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA空白管)÷W
C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)液濃度，10μmol/mL； V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積：0.3mL；V樣總：加入提取液體積：1mL；Cpr：樣品蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。
注意：最低檢測限為10nmol/mg prot或1μmol/g鮮重。
關(guān)鍵字： 線粒體檸檬酸（Mitochondrion;線粒體檸檬酸（Mitochondrion;
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