肉桂醇脫氫酶（ Cinnamyl-alcohol dehydrogenase，CAD)試劑盒說明書
分光光度法 50管/48樣
注 意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
CAD是木質(zhì)素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，是木質(zhì)素單體合成反應(yīng)中的最后一步，催化多種不同的肉桂醛（香豆醛、芥子醛以及松柏醛等）生成與之相應(yīng)的肉桂醇。該酶多存在于高等植物、酵母、菌類中，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理，為減少水果石細(xì)胞含量提高其品質(zhì)提供依據(jù)。
肉桂醇脫氫酶（ Cinnamyl-alcohol dehydrogenase，CAD)試劑盒測(cè)定原理：
CAD催化肉桂醇和NADP生成肉桂醛和NADPH，在340nm下測(cè)定NADPH生成速率，即可反映CAD活性。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體60mL×1瓶， 4℃保存；
試劑二：粉劑×2瓶，-20℃保存；
粗酶液提取：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
肉桂醇脫氫酶（ Cinnamyl-alcohol dehydrogenase，CAD)試劑盒測(cè)定步驟：
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測(cè)定
（1）在試劑二中加入25mL試劑一充分溶解混勻，室溫使用渦旋振蕩儀振蕩溶解15min，如未溶解可適當(dāng)延長(zhǎng)振蕩時(shí)間；置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴5min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后24h內(nèi)用完）；
（2）在1mL石英比色皿中加入50μL樣本和950μL試劑二，混勻，立即記錄340nm處初始吸光值A1和 5min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
CAD活性計(jì)算：
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
CAD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
CAD（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
CAD（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.286×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-3 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。
關(guān)鍵字： 肉桂醇脫氫酶（?Cinnamyl-alc;肉桂醇脫氫酶（?Cinnamyl-alc;
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