雙縮脲法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒說明書
分光光度法 50T/48S
注 意 ： 正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定，確保蛋白濃度在1～10mg/ml范圍內(nèi)。
測(cè)定意義：
樣品可溶性蛋白質(zhì)含量常常用于酶活性計(jì)算。此外，可溶性蛋白質(zhì)含量也用于食品等質(zhì)量分析。
雙縮脲法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒測(cè)定原理：
強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物；紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。該方法測(cè)定范圍為1~10mg蛋白質(zhì)，適用于蛋白質(zhì)濃度高的樣品，尤其是動(dòng)物材料。
自備儀器和用品：
離心機(jī)、可見分光光度計(jì)、移液器、1 mL玻璃比色皿和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體50mL×1瓶，4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品：液體1mL×1瓶，5 mg/mL，4℃保存。
樣品中可溶性蛋白質(zhì)提取：
1. 液體樣品：澄清無色液體樣品可以直接測(cè)定。
2. 組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液（自備，根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水））
冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即待測(cè)液。（動(dòng)物樣品常常需要稀釋）
3. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。
雙縮脲法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒測(cè)定操作：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到540 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 空白管：取1 mL玻璃比色皿，加入200μL蒸餾水，1000μL試劑一，混勻后室溫靜置15 min，于540nm比色，記為A空白管。
3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取1 mL玻璃比色皿，加入200μL標(biāo)準(zhǔn)液，1000μL試劑一，混勻后室溫靜置15 min，于540 nm比色，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。
4. 測(cè)定管：取1 mL玻璃比色皿，加入200μL待測(cè)液，1000μL試劑一，混勻后室溫靜置15 min，于540nm比色，記為A測(cè)定管。
注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。
雙縮脲法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒樣品中蛋白質(zhì)濃度計(jì)算公式：
C待測(cè)（mg/mL）= C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)
=5×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)
注意事項(xiàng)：
1.樣品蛋白濃度須在1~10mg/ml范圍內(nèi)，低于1mg/ml不能用此法，高于10mg/ml須做相應(yīng)稀釋。因此測(cè)定前用1~2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，確保蛋白濃度在1~10mg/ml范圍內(nèi)。
2.待測(cè)樣品蛋白提取可用生理鹽水、雙蒸水或不含蛋白的PBS提取。該法受硫酸銨、Tris緩沖液干擾，提取液中應(yīng)不含這些物質(zhì)；否則改用BCA蛋白質(zhì)含
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