產(chǎn)品及特點 研究真核基因的最基礎(chǔ)的工作之一就是確定其轉(zhuǎn)錄終止位點，目前最通用的方法是 3′-RACE 法，RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是 Frohman發(fā)明的、通過 PCR 快速克隆 cDNA 末端的技術(shù)，它在不建立 cDNA 文庫的前提下，利用已知 cDNA 序列設(shè)計引物，通過往兩端延伸和擴增獲得其 3′-端序列。本試劑盒就是根據(jù) 3′-RACE 原理而開發(fā)，它具有下列特點：

1. 即開即用，客戶不需要單獨準備各種材料。

2. 反應(yīng)條件經(jīng)過精心優(yōu)化，包括使用無 RNase H 活性的 MMLV 和優(yōu)化的引物。

3′-RACE 的原理如下圖：

規(guī)格及成分 成 分 編 號 小扁盒包裝

MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶-RI 混合物 101104a 10 μL(紅蓋)

RT Buffer（含 dNTP） 60906 50 μL(白蓋)

PCR MagicMix 3.0 90805 1 mL*2(紅蓋)

3′-RACE 引物 A（10 μM） yw373 10 μL(藍蓋)

3′-RACE 引物 B（10 μM） yw374 100 μL(綠蓋)

3′-RACE 引物 C（10 μM） yw375 100 μL(本色蓋)

RNase-Free 水 80403 1 mL(亮黃蓋)

使用手冊 101104sc 1 份

自備試劑 Poly(A) RNA（或總 RNA）、基因?qū)Ｒ恍砸?A、基因?qū)Ｒ恍砸?B、超純水。

運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存、有效期一年。 

使用方法 一：引物的設(shè)計和準備工作

利用已道序列的區(qū)域設(shè)計基因?qū)Ｒ恍砸锶龡l（A、B），其中引物 B 和 A 引物比較，靠 3’端 10-30 個堿基，類似巢式 PCR 的引物設(shè)計。自備的基因?qū)Ｒ恍砸锏?Tm 跟 3′-RACE 引物 B 和引物 C 的一致，即 Tm 為 58℃。引物合成后加超純水使其濃度為 10 μM，放冰上待用。

二：利用含 Oligo(dT)的 3’-RACE 引物 A 進行逆轉(zhuǎn)錄

3’RACE試劑盒注意：MMLV 酶使用前必須短暫離心，因為它含 50%甘油，及其粘稠，否則將取不到所需體積。

1. 在一個 PCR 管中，加入以下組分：

成分 用量

Poly(A) RNA（或總RNA ） 0.2-2 μg（5 μg）

3′-RACE引物A（10 μM） 1 μL

MMLV Buffer (含dNTP溶液) 5 μL

RNase-Free水 補至19 μL

合計 19 μL

注意：如果可能，使用Poly(A) RNA作為模板。

2. 65℃保溫 5 分鐘, 展開 RNA 的二級結(jié)構(gòu)，立即冰浴待用。

3. 在冰浴的 PCR 管中加入 1 μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶-RI 混合物。

4. 先 37℃保溫 60 分鐘，再 42℃保溫 30 分鐘進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最后 50℃保溫

10 分鐘終止反應(yīng)。

5. 加入 0.5 mL RNase-free 水稀釋上步得到的 cDNA，冰浴待用。長期放置需要

放-20℃保存。

三：利用基因?qū)Ｒ恍砸?A 和 3′ RACE 引物 B 進行輪 PCR

6. 用不同量的 RT 反應(yīng)液（即稀釋后的 cDNA 模板）設(shè)置 PCR，樣品組需要設(shè)置

模板用量梯度，單位：μL。

成分 梯度1 梯度2 梯度3 梯度4

稀釋后的 cDNA 1 5 10 15

基因?qū)Ｒ恍砸?A（10 μM） 2.5 2.5 2.5 2.5

3′ RACE 引物 B（10 μM） 2.5 2.5 2.5 2.5

98℃ 5 分變性 RNA-cDNA 雜交鏈，短暫離心后再加入下列成分

PCR MagicMix 3.0 25 25 25 25

RNase-free 水 19 15 10 5

合計 50 50 50 50

7. 按下列參數(shù)進行 cDNA 第二鏈的合成和 PCR：

第 1 步，cDNA 第二鏈的合成：52-60℃ 2分鐘，72℃ 40 分鐘（此步的目

地是合成第二鏈的 cDNA，復性溫度需要根據(jù)自備基因?qū)Ｒ恍砸?A 的 Tm

值決定，一般可以從 55℃開始）。

第二步 PCR 循環(huán)：94℃ 1分鐘，52-60℃ 1分鐘，72℃ 3分鐘，循環(huán)數(shù)

30。（此步為 PCR 擴增，復性溫度需要根據(jù)自備基因?qū)Ｒ恍砸?A 的 Tm

值決定，一般可以從 55℃開始）。

最后延伸：72℃ 15 分鐘。

8. 取 5 μL PCR 反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳以確認 PCR 擴增產(chǎn)物。若得到目的

擴增產(chǎn)物需要用于后續(xù)實驗，請于-20℃保存；若沒有得到目的擴增產(chǎn)物，可

按下列步驟進行巢式 PCR 反應(yīng)。

四：利用基因?qū)Ｒ恍砸?B 和 3′ RACE 引物 C 進行巢式 PCR 反應(yīng)

9. 將上輪 PCR 產(chǎn)物（4 管）用水稀釋約 20 倍（在 50μL PCR 反應(yīng)液中加入 1mL

超純水），然后分別作為模板進行巢式 PCR 擴增。PCR 反應(yīng)設(shè)置如下：

成分 1-4管

PCR MagicMix 3.0 各 25 μL

上步得到的PCR反應(yīng)液（稀釋20倍后） 4 種之一 1 μL

基因?qū)Ｒ恍砸?B（10 μM） 2.5 μL

3′ RACE 引物 C（10 μM） 2.5 μL

超純水 補至 50 μL

10. PCR 反應(yīng)。按下列條件進行 PCR：

第 1-30 次循環(huán)：94℃ 1分鐘，52-60℃ 1分鐘，72℃ 3分鐘（復性溫度需

要根據(jù)自備基因?qū)Ｒ恍砸?B 的 Tm 值進行優(yōu)化，一般可以從 55℃開始）。

最后延伸：72℃ 15 分鐘。

11. 電泳檢測。然后根據(jù)實驗結(jié)果進行 DNA 測序或 TA 克隆