取組織放入4%多聚甲醛里面固定3-4小時(shí),時(shí)間根據(jù)標(biāo)本大小適當(dāng)調(diào)整。
取適當(dāng)大小組織放入包埋盒中,進(jìn)行脫水。每個(gè)染缸液體體積約200ml,每次脫水可以裝20個(gè)包埋盒。依次進(jìn)入:
75%酒精1.5小時(shí)、95%酒精1.5小時(shí)、95%酒精1小時(shí)、無(wú)水乙醇1.5小時(shí)、無(wú)水乙醇1小時(shí)、二甲苯一號(hào)0.5小時(shí)、二甲苯二號(hào)0.5小時(shí)。
打開(kāi)包埋機(jī),分別開(kāi)啟冷臺(tái),冷點(diǎn),石蠟槽,組織槽進(jìn)行工作。然后用鐵飯盒承裝石蠟塊并放入包埋機(jī)組織槽中加熱溶解。將脫水后的組織連同包埋盒依次放入機(jī)器組織槽中,然后再放入石蠟飯盒一號(hào)進(jìn)行第二遍浸蠟,然后石蠟飯盒二號(hào),進(jìn)行三次浸蠟。
選大小符合的模具,先調(diào)整機(jī)器滴蠟的速度,不宜過(guò)快防止有氣泡。然后在模具中滴入液體石蠟,然后從飯盒二號(hào)中拿出浸后的包埋盒,打開(kāi)用鑷子取出組織放入模具中。然后用包埋盒的另一半蓋住模具,再滴入少許石蠟后放到冷臺(tái)上冷卻。按上述步驟繼續(xù)包埋下一個(gè)蠟塊。
室溫脫蠟、水化:二甲苯一號(hào)10分鐘、二甲苯二號(hào)8分鐘、二甲苯三號(hào)8分鐘、無(wú)水乙醇5分鐘、90%乙醇3分鐘、80%乙醇3分鐘、70%乙醇3分鐘。蒸餾水3分鐘*3次,PBS3分鐘*3次。
熱抗原修復(fù),換新的切片架,放入水化后的切片。配置抗原修復(fù)液(一包檸檬酸鈉粉末配置2升PBS溶液),用鐵飯盒或者鍋加熱煮沸。溫度控制在96-98度。然后將切片放入熱鍋中15分鐘,最后自然冷卻室溫。PBS五分鐘*2次,蒸餾水3分鐘*2次。
免疫組化筆畫(huà)圈:取出組織,甩干水分,可用吸水紙吸干水珠。用組化筆畫(huà)圈圍住組織,圓圈完整。
滅活內(nèi)源酶活性:將切片放入濕盒中,盒中加入少量蒸餾水,滴加3%過(guò)氧化氫(二抗試劑盒中A一滴或者50微升,劑量詳見(jiàn)二抗說(shuō)明書(shū)),室溫孵育10分鐘。PBS三分鐘*3次,蒸餾水水洗三分鐘。
封閉非特異性位點(diǎn):甩干水分,吸干水珠,加山羊血清封閉液(二抗試劑盒B一滴或者50微升),放入濕盒內(nèi),室溫10分鐘。
甩掉封閉液,滴加一抗蓋住組織,然后放入濕盒內(nèi)4攝氏度過(guò)夜。(一抗?jié)舛纫?jiàn)抗體說(shuō)明書(shū),提前稀釋后分裝,并在負(fù)二十度冰箱保存。每張片子一抗劑量不定,看組織面積大小,xxxxx癌組織一張20微升左右。
第二天,4度冰箱取出濕盒,室溫復(fù)溫30分鐘,PBS三分鐘*三次,蒸餾水洗滌三分鐘。
甩干水分,吸干水珠,滴加二抗(二抗試劑盒C)一滴或者50微升,室溫孵育10分鐘。PBS三分鐘*三次,蒸餾水水洗三分鐘。
每張片子滴加一滴或者50微升鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液(二抗試劑盒D),室溫孵育10分鐘,PBS三分鐘*三次,蒸餾水水洗三分鐘。
每張片子滴加兩滴或者100微升DAB溶液,顯微鏡下觀察3-10分鐘。染色合適即可終止染色,自來(lái)水沖洗。
蘇木素復(fù)染,1-2分鐘,細(xì)胞核變藍(lán)色即可終止,自來(lái)水或者PBS沖洗反藍(lán)(可用0.5%氨水反藍(lán))。
1%鹽酸酒精分化3秒,自來(lái)水沖洗三分鐘。
脫水:70%酒精1分鐘、80%酒精1分鐘、95%酒精2分鐘、無(wú)水乙醇4分鐘、二甲苯一號(hào)3分鐘、二甲苯二號(hào)3分鐘。
涼干片子后滴加適量中性樹(shù)膠封片,蓋上蓋玻片,小心氣泡。晾干半天即可。
顯微鏡下拍照。