鐵死亡：脂質(zhì)過氧化的最終結(jié)局

鐵死亡（Ferroptosis）是一種鐵離子催化和活性氧誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致的調(diào)節(jié)性細(xì)胞壞死，其特征是當(dāng)細(xì)胞內(nèi)還原系統(tǒng)失活后，細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜上含有不飽和脂肪酸長(zhǎng)鏈的磷脂分子被過氧化破壞，造成的細(xì)胞膜破裂。鐵死亡的兩大特征是鐵離子累積和脂質(zhì)過氧化。鐵死亡與經(jīng)典的細(xì)胞凋亡不同，過程中沒有細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)凝集等現(xiàn)象，但會(huì)出現(xiàn)線粒體皺縮和脂質(zhì)過氧化增加。

（一）鐵死亡的發(fā)現(xiàn)

1. Dolma等于2003年發(fā)現(xiàn)了一種新的化合物Erastin，能夠選擇性致死表達(dá)RASV12蛋白的腫瘤細(xì)胞，但是Erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡沒有凋亡相關(guān)的細(xì)胞核形態(tài)的改變、DNA片段化、Caspase3活化等表現(xiàn)，并且這個(gè)過程不能被caspase抑制劑所逆轉(zhuǎn)。因此Erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是一種新的死亡形式。
2. 隨后Yang和Yagoda等發(fā)現(xiàn)這種死亡形式可以被鐵螯合劑所抑制，且伴有細(xì)胞內(nèi)活性氧的增多，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了另一種可引起此種死亡形式的化合物-Ras選擇性致死化合物（Ras-selective-lethal compound 3，RSL3）。
3. 2012年哥倫比亞大學(xué)Brent R. Stockwell等根據(jù)其特點(diǎn)，正式將這種死亡形式命名為鐵死亡：一種鐵依賴性的，以細(xì)胞內(nèi)活性氧堆積為特征的非細(xì)胞凋亡形式的細(xì)胞死亡。當(dāng)細(xì)胞胱氨酸運(yùn)輸?shù)鞍资艿揭种疲ㄈ?/span>Erastin）后，胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）會(huì)被耗盡，最終導(dǎo)致谷胱甘肽過氧化物酶（GPX4）的失活和脂質(zhì)過氧化積累，達(dá)到一定程度后即可誘發(fā)細(xì)胞死亡。GPX4酶受到抑制（如RSL3）后，也可以直接導(dǎo)致這一作用，而鐵離子螯合劑可以抑制這一過程。

哥倫比亞大學(xué)Brent R. Stockwell首次提出鐵死亡

（二）鐵死亡的機(jī)制研究

鐵死亡主要是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧生成與降解的平衡失調(diào)所致。當(dāng)細(xì)胞抗氧化能力降低，脂質(zhì)活性氧堆積，就能引起細(xì)胞鐵死亡。目前研究顯示，鐵死亡的通路包括以下重要環(huán)節(jié)。

鐵死亡通路和相關(guān)的分子、誘導(dǎo)劑和抑制劑

鐵死亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)（1）：脂質(zhì)活性氧的形成

無論是Erastin還是RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡，均涉及到鐵依賴性的脂質(zhì)活性氧的堆積。但是脂質(zhì)活性氧的確切來源尚不明確。細(xì)胞膜脂質(zhì)的多不飽和脂肪酸 （polyunsaturatedfattyacids，PUFAs）鏈經(jīng)過一系列的反應(yīng)形成脂質(zhì)活性氧。PUFAs經(jīng)過酶促或非酶促的氧化反應(yīng)，可形成脂質(zhì)氫過氧化物。在鐵存在的情況下，脂質(zhì)氫過氧化物能形成有毒性的脂質(zhì)自由基，如烷氧基自由基，造成細(xì)胞損傷。并且，這些自由基能轉(zhuǎn)移鄰近PUFAs的質(zhì)子，啟動(dòng)新一輪的脂質(zhì)氧化反應(yīng)并進(jìn)一步傳遞氧化性損害。在Erastin處理的腫瘤細(xì)胞及GPX4缺失的小鼠細(xì)胞中，脂質(zhì)活性氧的堆積和PUFAs的減少，均可被小分子抗氧化劑ferropstatin-1所抑制，從而阻斷鐵死亡的過程。因此，脂質(zhì)活性氧介導(dǎo)的細(xì)胞損傷是鐵死亡所必需的。

鐵死亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)（2）：鐵的作用

鐵是鐵死亡過程的必要條件，各種鐵螯合劑均能抑制細(xì)胞的鐵死亡。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體能夠促進(jìn)細(xì)胞外鐵轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，其編碼基因TFRC的沉默，能夠抑制Erastin引起的鐵死亡。相反，補(bǔ)充鐵離子可以加速Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡，其他二價(jià)金屬離子卻不起作用。這些結(jié)果更證明了鐵離子在鐵死亡過程中的必要性。

鐵離子在細(xì)胞鐵死亡中的確切作用是什么？這與鐵向氧化物傳遞電子有關(guān)。

鐵螯合劑能夠抑制鐵死亡，最有可能的解釋是阻止了鐵向氧化物傳遞電子，從而抑制活性氧的生成。親脂性鐵螯合劑能夠穿過細(xì)胞膜并螯合游離鐵，阻止鐵催化脂質(zhì)自由基的形成，抑制了PUFAs的降解。也有報(bào)道提出，鐵螯合劑能夠直接作用于含鐵離子的酶，從而抑制脂質(zhì)過氧化。其中脂氧合酶最有可能介導(dǎo)鐵依賴性的脂質(zhì)活性氧形成，因?yàn)樗艽呋疨UFAs的氧化，并且能直接被親脂性鐵螯合劑失活。其他鐵依賴性的酶，如脯氨酸羥化酶1 （prolylhydroxylases1，PHD1） ，也可能是鐵螯合劑的靶點(diǎn)，但是其推動(dòng)脂質(zhì)活性氧生成的能力遠(yuǎn)不如脂氧合酶。

與親脂性鐵螯合劑不同，去鐵胺 （deferoxamine，DFO） 是無膜通透性的鐵螯合劑，能夠通過細(xì)胞內(nèi)吞作用堆積于細(xì)胞溶酶體。過氧化氫等致死性物質(zhì)對(duì)細(xì)胞處理后會(huì)引起溶酶體的破壞，但Erastin引起的鐵死亡卻未曾發(fā)現(xiàn)溶酶體的破壞。因此，DFO可能與溶酶體發(fā)生作用，截取溶酶體中本應(yīng)轉(zhuǎn)運(yùn)至其他部位的鐵離子，從而阻止脂質(zhì)活性氧的生成。

鐵死亡的信號(hào)通路

谷胱甘肽過氧化物酶 （glutathione peroxidase，GPXs） 與鐵死亡

鐵死亡的上游通路，最終都是通過直接或間接影響谷胱甘肽過氧化物酶 （glutathione peroxidase，GPXs） 的活性，降低細(xì)胞抗氧化能力，致使脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增加，脂質(zhì)活性氧增多，最終引起鐵死亡。所以，GPXs家族在鐵死亡過程中起關(guān)鍵作用。

GPXs家族有許多成員，包括GPX1~GPX8，其中GPX4在鐵死亡中扮演著更加重要的角色。GPX4是脂質(zhì)過氧化過程的抑制蛋白，能夠降解小分子過氧化物以及相對(duì)復(fù)雜的脂質(zhì)過氧化物。用siRNA敲低細(xì)胞的GPX4表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)鐵死亡更敏感，相反，上調(diào)GPX4的表達(dá)則會(huì)產(chǎn)生對(duì)鐵死亡的耐受。

RSL3是重要的鐵死亡誘導(dǎo)劑，用熒光素標(biāo)記的RSL3處理細(xì)胞后進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)GPX4是RSL3的靶蛋白。另外，其他的一些化合物，如DPI7、DPI10等，同樣能夠直接作用于GPX4。這些化合物通過抑制GPX4的活性，致細(xì)胞抗氧化能力下降，脂質(zhì)活性氧上升，最終引起鐵死亡。

此外，甲羥戊酸通路 （mevalonatepath，MVA通路） 可通過調(diào)節(jié)硒代半胱氨酸t(yī)RNA的成熟而作用于GPX4，引起細(xì)胞的鐵死亡。硒代半胱氨酸是GPX4活性中心的氨基酸之一，而將其嵌入GPX4則需要特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)體——硒代半胱氨酸t(yī)RNA。硒代半胱氨酸t(yī)RNA的成熟需要異戊烯基轉(zhuǎn)移酶將異戊烯焦磷酸 （isopentenylpyrophosphate，IPP） 中的異戊烯基轉(zhuǎn)移至硒代半胱氨酸t(yī)RNA前體，而IPP是MVA通路的產(chǎn)物。因此，MVA通路可以通過下調(diào)IPP，進(jìn)而影響硒代半胱氨酸t(yī)RNA的合成，進(jìn)一步干涉GPX4的活性，引起鐵死亡。

胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)受體 （system Xc-）與鐵死亡

通過器官型海馬腦片培養(yǎng)模型（OHSC），發(fā)現(xiàn)谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性毒性細(xì)胞死亡過程中有鐵死亡參與。在谷氨酸誘導(dǎo)興奮性毒性細(xì)胞死亡的過程中，谷氨酸可以啟動(dòng)兩條通路，一條為鈣離子的流入，一條為對(duì)依賴system Xc-的胱氨酸吸收通路的抑制。而鈣離子的螯合劑，乙二醇雙 （2-氨基乙基醚） 四乙酸對(duì)Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡沒有抑制作用。β巰基乙醇 （β-ME） 能夠在不通過system XC-情況下促進(jìn)胱氨酸的吸收，而它恰恰能夠顯著抑制Erastin、谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。因此推斷，system XC-介導(dǎo)的胱氨酸吸收在鐵死亡中有重要作用。在Erastin和柳氮磺胺吡啶誘導(dǎo)的鐵死亡中發(fā)現(xiàn)了SLC7A11的上調(diào)。System XC-是由SLC7A11和SLC3A2組成的異二聚體。對(duì)system XC-的抑制會(huì)導(dǎo)致SLC7A11的代償性轉(zhuǎn)錄上調(diào)，

而抑制system XC-，阻礙胱氨酸的吸收后，又通過怎樣的路徑導(dǎo)致鐵死亡？Yang等發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽（glutathione，GSH）的減少會(huì)導(dǎo)致GPXs活性降低。GPXs能夠催化過氧化氫和氫過氧化物的降解，抑制脂質(zhì)活性氧的生成，而谷胱甘肽是其必需的輔助因子。

綜上，Erastin通過抑制system XC-，阻礙了谷胱甘肽的吸收，谷胱甘肽又是GPXs發(fā)揮作用的必要輔助因子，因此導(dǎo)致GPXs活性降低，細(xì)胞抗過氧化能力降低，脂質(zhì)活性氧堆積，引起細(xì)胞的氧化性死亡。

p53介導(dǎo)的鐵死亡

p53基因是重要的抑癌基因，其介導(dǎo)的細(xì)胞周期抑制、衰老、凋亡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用。Jiang等用ROS處理p53基因沉默的H1299細(xì)胞，細(xì)胞活性沒有變化，但激活p53基因后再用ROS處理，細(xì)胞死亡率高達(dá)90%，說明p53基因激活后細(xì)胞抗氧化能力顯著降低。再向其加入鐵死亡抑制劑ferrostatin-1后，細(xì)胞死亡率下降約40%，從而發(fā)現(xiàn)p53不僅可以引起細(xì)胞凋亡，也能誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡。Jiang等發(fā)現(xiàn)上調(diào)p53基因表達(dá)后，SLC7A11的信使RNA和蛋白表達(dá)量顯著降低，從而證實(shí)SLC7A11為p53基因的新靶點(diǎn)。而system XC-正是由SLC7A11和SLC3A2組成的異二聚體。因此，p53可通過下調(diào)SLC7A11的表達(dá)從而抑制system XC-吸收胱氨酸，致使胱氨酸依賴的谷胱甘肽過氧化物酶活性降低，細(xì)胞抗氧化能力降低，脂質(zhì)活性氧升高，引起細(xì)胞鐵死亡。

VDACs與鐵死亡

電壓依賴性陰離子通道 （voltage-dependent anion channels，VDACs） 是轉(zhuǎn)運(yùn)離子和代謝產(chǎn)物的跨膜通道，Yagoda等發(fā)現(xiàn)Erastin可作用于VDACs。用siRNA干預(yù)VDAC2或VDAC3表達(dá)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)Erastin引起的鐵死亡產(chǎn)生耐性，但是過表達(dá)VDAC2和VDAC3并未提高細(xì)胞對(duì)Erastin的敏感性，所以，VDAC2和VDAC3是鐵死亡的必要非充分條件。此外，Erastin還可導(dǎo)致線粒體外膜通透性的改變。因此Yagoda認(rèn)為Erastin作用于VDACs，引起線粒體功能紊亂，氧化性物質(zhì)釋放，最終引起細(xì)胞氧化性死亡。

鐵死亡的其他調(diào)節(jié)通路

除了上述鐵死亡的主要發(fā)生機(jī)制外，鐵死亡還可以受到其他通路的調(diào)節(jié)。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，甲硫氨酸可通過硫轉(zhuǎn)移途徑 （the sulphur-transfer pathway） 轉(zhuǎn)化為胱氨酸，合成谷胱甘肽，協(xié)助谷胱甘肽過氧化物酶抑制脂質(zhì)活性氧生成，避免氧化性細(xì)胞損傷。因此硫轉(zhuǎn)移途徑可抑制鐵死亡的發(fā)生；血紅素加氧酶1 （hemeoxygenase-1，HO-1） 是細(xì)胞內(nèi)鐵的重要來源之一，Kwon等證實(shí)了其可以誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)從而導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生；轉(zhuǎn)鐵蛋白也是細(xì)胞內(nèi)鐵的來源之一，它亦參與了鐵死亡的調(diào)節(jié)過程。

（三）鐵死亡與疾病

1. 鐵死亡與腫瘤

鐵死亡在有關(guān)腫瘤的研究中成為近幾年的熱點(diǎn)之一，過量鐵的氧化應(yīng)激與致癌作用有關(guān)。通過抑制system Xc-抑制胱氨酸攝取的藥物，如柳氮磺胺吡啶（sulfasalazine），可阻止腫瘤的生長(zhǎng)并在某些情況下誘發(fā)鐵死亡。同樣，使用工程改造的胱氨酸降解酶偶聯(lián)物從血漿中直接去除胱氨酸，可阻止腫瘤生長(zhǎng)并觸發(fā)細(xì)胞死亡。

SLC7A11在多種類型的人類癌癥中高表達(dá)，并與患者生存率負(fù)相關(guān)，高表達(dá)的SLC7A11通過促進(jìn)胱氨酸的攝取，合成還原性GSH保護(hù)癌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和鐵中毒，越來越多的證據(jù)表明SLC7A11是一種潛在的腫瘤生物標(biāo)志物。2019年密歇根大學(xué)鄒偉平教授團(tuán)隊(duì)在Nature上發(fā)表文章，首次揭示CD8+ T細(xì)胞可以通過IFNγ調(diào)控腫瘤細(xì)胞的鐵死亡過程。目前，越來越多的證據(jù)表明鐵死亡可作為腫瘤抑制新靶點(diǎn)。

1. 鐵死亡與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

研究證實(shí)鐵死亡抑制劑（ferrostatins 和liproxstatins等）在包括帕金森氏癥（PD），亨廷頓氏癥（HD）和阿爾茨海默癥（AD）在內(nèi)的退化性腦疾病模型中，以及在其他形式的神經(jīng)退行性疾病，創(chuàng)傷性和出血性腦損傷中均具有保護(hù)作用。在 GPX4 選擇性敲除后建立的小鼠模型中，小鼠迅速出現(xiàn)麻痹狀態(tài)，并在 8 周內(nèi)死去，補(bǔ)充了維生素 E（鐵死亡抑制劑）的對(duì)照組，小鼠麻痹和死亡時(shí)間均推遲。對(duì)其病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)小鼠脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)生嚴(yán)重退化。從而證實(shí)GPX4 在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的重要作用。在PD中，凋亡、自噬、壞死、鐵死亡等多種細(xì)胞死亡方式均參與多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡。

1. 鐵死亡與肝臟損傷的關(guān)系

科學(xué)家運(yùn)用多種基因敲除小鼠模型，首次發(fā)現(xiàn)高鐵狀態(tài)以及遺傳性血色病鐵過載可誘發(fā)肝臟（肝細(xì)胞及巨噬細(xì)胞）發(fā)生鐵死亡，并且揭示了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC7A11調(diào)控鐵死亡的新機(jī)制，為肝臟損傷及血色病等系列重大疾病的防治提供了新思路。

1. 鐵死亡抑制子FSP1發(fā)現(xiàn)

GPX4抑制劑能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，但不同腫瘤細(xì)胞系對(duì)GPX4抑制劑反應(yīng)效果相差很大，暗示細(xì)胞中還存在其他的鐵死亡抑制子。2019年加州大學(xué)伯克利分校Olzmann教授與德國(guó)環(huán)境健康研究中心Conrad教授和維爾茨堡大學(xué)Angeli教授各自研究成果，共同揭示了一個(gè)新的鐵死亡抑制子FSP1。

（四）鐵死亡的特征

鐵死亡的實(shí)質(zhì)是由于膜脂修復(fù)酶—谷胱甘肽過氧化物酶（GPX4）失效，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化物代謝障礙，在鐵離子催化作用下，造成膜脂上活性氧自由基（ROS）堆積，使細(xì)胞內(nèi)氧化還原失衡，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，釋放前炎癥介質(zhì)（如HMGB1等）。GPX4酶受到抑制（如RSL3）也可以直接導(dǎo)致這一作用，而鐵離子螯合劑則可以抑制這一過程。

鐵死亡在細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生化特征以及基因水平上都與凋亡、自噬、壞死等傳統(tǒng)的細(xì)胞死亡方式具有顯著的差異，具體表現(xiàn)為：

1. 細(xì)胞形態(tài)變化

超微形態(tài)學(xué)特征顯示細(xì)胞膜斷裂和出泡，線粒體變小、膜密度增高、線粒體脊減少或消失、線粒體外膜斷裂，細(xì)胞核大小正常、但缺乏染色質(zhì)凝聚。電鏡下表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)線粒體變小及雙層膜密度增高。

鐵死亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征

1. 生化特征變化

鐵和活性氧（ROS）聚集，激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）系統(tǒng)，降低胱氨酸的攝取、耗盡胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH），抑制胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白system Xc-（由兩個(gè)亞基組成，輕鏈亞基SLC7A11（也稱為xCT）和重鏈亞基SLC3A2（也稱為CD98））和增加NADPH氧化酶（NOXs），釋放花生四烯酸（arachidonic acid, ARA）等介質(zhì)。

1. 基因水平變化

鐵死亡受細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的嚴(yán)密調(diào)節(jié)，包括鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)通路，RAS/Raf/MAPK通路以及胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)通路。細(xì)胞內(nèi)Cox2， ACSL4， NOX1， GPX4， SLC7A11， Ferritin和Ferritin Light Chain等相關(guān)因子發(fā)生變化，其中Cox2， ACSL4和NOX1在鐵死亡細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)； GPX4， SLC7A11， Ferritin和Ferritin Light Chain在鐵死亡細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。

（五）鐵死亡常見檢測(cè)方法

1. 形態(tài)學(xué)觀察

1. 細(xì)胞形態(tài)觀察：利用透射電鏡直接對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時(shí)線粒體變小以及線粒體膜密度較大。
2. 線粒體形態(tài)觀察：向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染LifeAct-GFP熒光蛋白，一定時(shí)間后通過有絲分裂追蹤器觀察線粒體的形態(tài)。

1. 新陳代謝檢測(cè)

1. 細(xì)胞活性檢測(cè)：CCK-8
2. 細(xì)胞內(nèi)鐵水平檢測(cè)：可以使用PGSK探針檢測(cè)，通過流式細(xì)胞術(shù)或共聚焦顯微鏡監(jiān)測(cè)活細(xì)胞內(nèi)鐵含量的細(xì)胞膜透性染料，在鐵死亡的細(xì)胞中，PGSK的綠色熒光會(huì)減弱。
3. 活性氧水平檢測(cè)：通過C11-BODIPY探針檢測(cè)，在鐵死亡細(xì)胞中，探針會(huì)由紅色轉(zhuǎn)化為綠色。
4. 線粒體膜電位檢測(cè)：可以使用TMRE熒光染料檢測(cè)，TMRE能夠特異性標(biāo)記有活性的線粒體，是一種細(xì)胞膜可穿透性的，正電荷的，橘紅色熒光染料。當(dāng)線粒體膜電位降低時(shí)，熒光減弱。
5. qPCR/Western Blot檢測(cè)：檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)與鐵死亡相關(guān)的因子變化，例如Cox2， ACSL4和NOX1在鐵死亡細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)； GPX4， SLC7A11， Ferritin和Ferritin Light Chain在鐵死亡細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。

鐵死亡相關(guān)ELISA試劑盒、抗體列表