替米考星檢測(cè)試劑盒

使用說明書

（酶聯(lián)免疫法）https://www.yajimall.com/

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，檢測(cè)組織、肝臟、蜂蜜、雞蛋和牛奶中的替米考星含量。試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的替米考星和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗替米考星抗體，再與酶標(biāo)記物形成抗原抗體復(fù)合物，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其替米考星含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較乘以樣本稀釋倍數(shù)即可得出樣本中替米考星的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.5ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～15min

2.3 檢測(cè)下限：

動(dòng)物組織（高檢測(cè)限） ……… 0.5ppb

動(dòng)物組織（低檢測(cè)限） ……… 10ppb

肝臟（雞肝、 豬肝）………… 10ppb

蜂蜜…………………………… 1ppb

雞蛋、牛奶…………………… 5ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

替米考星 ………………………100%

泰樂菌素………………………… 1%

2.5 樣本回收率：

動(dòng)物組織（高檢測(cè)限）……… 90%±20%

動(dòng)物組織（低檢測(cè)限）……… 90%±20%
肝臟（雞肝、鴨肝、豬肝）… 75%±15%
蜂蜜…………………………… 95%±25%
雞蛋、牛奶…………………… 95%±25%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml

0ppb、0.5ppb、1.5 ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液：1ppm

酶標(biāo)記物（紅蓋）……………………5.5ml

抗體工作液（藍(lán)蓋）…………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

2×復(fù)溶液（黃蓋） …………………50ml

20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

說明書…………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個(gè)

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、振蕩器、氮?dú)獯蹈裳b置、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?/span>20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：無水碳酸鈉（分析純）；碳酸氫鈉（分析純）； 甲醇（分析純） ；乙酸乙酯（分析純）；去離子水；正已烷

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.2 配液：

配液 1: 0.1M (PH=10.6) CB 緩沖液
    稱取 0.932g 無水碳酸鈉和 0.1g 碳酸氫鈉加入 100ml 去離子水溶解混勻。
配液 2: 0.5M (PH=10.6) CB 緩沖液
    稱取 4.66g 無水碳酸鈉和 0.5g 碳酸氫鈉加入 100ml 去離子水溶解混勻。

配液 3:復(fù)溶液

1 份 2× 復(fù)溶液 +1 份去離子水混勻，即可得到復(fù)溶液。 
配液 4: 牛奶、雞蛋稀釋液
    取復(fù)溶液與甲醇按 19:1 體積比混合，即（ 19 份復(fù)溶液 +1 份甲醇）。
配液 5: 洗滌工作液

用去離子水將 20× 濃縮洗滌液按 1 ： 19 體積比進(jìn)行

稀釋（ 1 份 20× 濃縮洗滌液 +19 份去離子水）用于酶標(biāo)板的洗滌， 洗滌工作液在 4 ℃（ 39.2 ℉）環(huán)境可保存一個(gè)月 。

5.3.1高檢測(cè)限樣本前處理方法

動(dòng)物組織（豬肉、 雞肉、 牛肉、 羊肉、 魚、 蝦）

1、稱取 2.0 ± 0.05g 均質(zhì)后的組織樣本至 50ml 聚苯乙烯    

   離心管中，分別加入 2ml 0.1M （ PH=10.6 ） CB( 配液 1)  

   和 8ml 乙酸乙酯，用渦動(dòng)儀渦動(dòng) 3min ，3000r/min 
   室溫離心 5min ；        

2、取 4ml 上層有機(jī)相至 10ml 潔凈干燥玻璃管中，于   

   50-60 ℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?/span>

3、 加入 1ml 正已烷，用渦旋儀渦動(dòng) 30s ，再加入 1ml   

   復(fù)溶液， 用渦旋儀渦動(dòng) 30s ， 3000 r/min 室溫離心  

   5min ；

4、除去上層，取下層 50μl 用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1        檢測(cè)下限：0.5ppb

5.3.2低檢測(cè)限樣本前處理方法

動(dòng)物組織（豬肉、 雞肉、 牛肉、 羊肉、 魚、 蝦）

1、 稱取 1.0 ± 0.05g 均質(zhì)后的樣本至 50ml 聚苯乙烯離心

   管中，加入 4ml 洗滌工作液（配液 5 ），用渦動(dòng)儀
   渦動(dòng) 3min ， 3000 r/min室溫離心 5min ；

2、 取 200μl 上層清液，再加入 600μl復(fù)溶液，用渦旋儀渦動(dòng) 30s ，混勻；

3、取 50μl 用于分析。 

樣本稀釋倍數(shù)：20      檢測(cè)下限：10ppb

5.3.3 肝臟（雞肝、鴨肝、豬肝）

1、稱取 1.0 ± 0.05g 均質(zhì)后的樣本至 50ml 聚苯乙烯離心管中， 分別加入 2ml 0.5M （ PH=10.6 ） CB( 配液 2) 和8ml 乙酸乙酯，用渦動(dòng)儀渦動(dòng) 3min ，3000 r/min 室溫離心 5min ；

2、取 2ml上層有機(jī)相至 10ml 潔凈干燥玻璃管中，于50-60 ℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?/span>

3、加入 1ml 正已烷，用渦旋儀渦動(dòng)30s，再加入1ml復(fù)溶液，用渦旋儀渦動(dòng) 30s，3000 r/min 室溫離心5min；

4、 除去上層，取 100μl下層加 400μl復(fù)溶液，用渦旋儀渦動(dòng) 30s，混勻；

5、取 50μl 用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：20      檢測(cè)下限：10ppb

5.3.4蜂蜜

1、稱取 2.0 ± 0.05g 蜂蜜樣本至 50ml 聚苯乙烯離心管中， 分別加入 2ml 0.1M （ PH=10.6 ） CB( 配液1），和 8ml乙酸乙酯，用渦動(dòng)儀渦動(dòng) 3min ， 3000g 室溫離心 5min ；

2、取 2ml 上層有機(jī)相至 10ml 潔凈干燥玻璃管中，于 50-60 ℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?/span>

3、加入 1ml復(fù)溶液 ，用渦旋儀渦動(dòng) 30s ，混勻；

4、取 50μl 用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：2      檢測(cè)下限：1ppb

5.3.5、雞蛋

1、用均質(zhì)器低速均質(zhì)雞蛋樣本；

2、取 100μl 均質(zhì)后的雞蛋樣本加 900μl 雞蛋稀釋液  ( 配液 4) ，用渦旋儀渦動(dòng) 30s ，混勻；

3、取 50μl 用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：10     檢測(cè)下限：5ppb

5.3.6 牛奶

1、取 100μl 鮮牛奶樣本；

2、加入 900μl 牛奶稀釋液 ( 配液 4) ，用渦旋儀渦動(dòng) 30s ，混勻；

3、取 50μl 用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：10     檢測(cè)下限：5ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 編    號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)30分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干。（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍(lán)色過淺，可適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間）。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.6 測(cè)吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm）。測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計(jì)算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索?。?/span>

8 注意事項(xiàng)

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。           

9 貯藏及保存期

儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。