培養(yǎng)基OPTI-MEM
一、實驗概述
本文旨在總結(jié)利用無血清培養(yǎng)基OPTI-MEM進行貼壁細(xì)胞（如CHO細(xì)胞）脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的實驗步驟、個人經(jīng)驗以及常見問題分析。通過遵循本指南，實驗者可以更有效地進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，提高轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率。
二、實驗材料
- 宿主細(xì)胞：CHO（貼壁細(xì)胞）
- 脂質(zhì)體：LIPOFECTAMINE 2000（Invitrogen公司）
- 細(xì)胞培養(yǎng)板：6孔細(xì)胞培養(yǎng)板
- 無血清培養(yǎng)基：OPTI-MEM（GIBCO）
- 轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒
三、實驗步驟
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細(xì)胞接種：轉(zhuǎn)染前一天，以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度（如34×10^5/ml）接種到6孔培養(yǎng)板上。轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞應(yīng)達(dá)到9095%的融合。
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制備溶液：
- 溶液1：240μl OPTI-MEM + 10μl LIPOFECTAMINE 2000（總體積250μl），溫育5分鐘。
- 溶液2：Xμl OPTI-MEM + 4μg 質(zhì)粒（總體積250μl）。
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混合溶液：將溶液1與溶液2混合，室溫下靜置20分鐘。
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細(xì)胞準(zhǔn)備：將6孔板中的細(xì)胞用OPTI-MEM沖洗兩遍后，加入2ml OPTI-MEM。
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加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物：將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中，搖動培養(yǎng)板輕輕混勻。在37℃，5%的CO2中保溫5~6小時。
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更換培養(yǎng)基：6小時后，更換含有血清的全培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃，5%的CO2中培養(yǎng)48~72小時以檢測轉(zhuǎn)染水平。
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穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（可選）：如需進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，換全培養(yǎng)基培養(yǎng)后24小時，以1：10或更高的稀釋比例接種到新的培養(yǎng)板，加抗生素進行篩選。
四、個人經(jīng)驗分享
- 細(xì)胞狀態(tài)：確保細(xì)胞處于最佳生長狀態(tài)，避免使用傳代過多的細(xì)胞。
- 細(xì)胞融合度：細(xì)胞融合度需達(dá)到90%以上以確保轉(zhuǎn)染效果。
- 無血清培養(yǎng)基選擇：OPTI-MEM優(yōu)于PBS或無血清的DMEM，可提高轉(zhuǎn)染效率。
- 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒質(zhì)量：確保質(zhì)粒純度高、濃度高、無內(nèi)毒素。
- 轉(zhuǎn)染時間：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)時間不宜過長，以避免對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。
五、常見問題分析及解決方案
- 細(xì)胞死亡：
- 可能原因：細(xì)胞對OPTI-MEM敏感或細(xì)胞狀態(tài)不佳。
- 解決方案：嘗試使用其他無血清培養(yǎng)基或調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)。
- 轉(zhuǎn)染效率下降：
- 可能原因：細(xì)胞接種后培養(yǎng)時間過長，導(dǎo)致細(xì)胞對轉(zhuǎn)染不敏感。
- 解決方案：確保細(xì)胞在接種后24小時左右進行轉(zhuǎn)染，以保證細(xì)胞處于對數(shù)生長期。
- 轉(zhuǎn)染試劑毒性：
- 可能原因：LIPOFECTAMINE 2000毒性較高。
- 解決方案：考慮更換其他轉(zhuǎn)染試劑或調(diào)整轉(zhuǎn)染條件。
六、經(jīng)驗推薦
- OPTI-MEM相較于PBS和無血清的DMEM培養(yǎng)基，具有更高的轉(zhuǎn)染效率。
- 在制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物時，使用無血清培養(yǎng)基OPTI-MEM可提高轉(zhuǎn)染效率。
- 轉(zhuǎn)染后應(yīng)及時更換含有血清的全培養(yǎng)基，以避免無血清培養(yǎng)基對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。
遵循本指南中的實驗步驟和建議，實驗者可以更有效地進行貼壁細(xì)胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，提高轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率。
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