在生物成像領(lǐng)域，熒光蛋白和 RNA 傳感器一直是重要工具。然而，由于蛋白質(zhì)和 RNA 的穩(wěn)定性和多功能性有限，開發(fā)更通用、更穩(wěn)定的傳感器成為一個(gè)重要課題。
近日，美國德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校的陸藝教授和合作者在JACS 雜志上發(fā)表了一種新型的基因編碼熒光 DNA 核酸適配體（Genetically Encoded Fluorogenic DNA Aptamer, GEFDA）傳感器，用于在活細(xì)胞中實(shí)時(shí)監(jiān)測代謝物濃度。
圖1. 基因編碼熒光 DNA 核酸適配體用于活細(xì)胞代謝物的實(shí)時(shí)成像
目前的熒光傳感器多基于熒光蛋白和 RNA 核酸適配體。然而，這些工具在小分子分析物檢測方面面臨瓶頸，例如結(jié)合范圍有限、穩(wěn)定性不足等問題。相比之下，DNA 核酸適配體具有更高的穩(wěn)定性和更廣的結(jié)合范圍，但傳統(tǒng)的 DNA 核酸適配體需要事先標(biāo)記熒光染料并遞送至細(xì)胞內(nèi)，這限制了其實(shí)時(shí)監(jiān)測能力。
本研究提出了一種新策略，將 DNA 核酸適配體編碼至能夠利用反轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)單鏈DNA的質(zhì)粒中，并通過細(xì)胞內(nèi)表達(dá)持續(xù)生成傳感器，克服了傳統(tǒng)方法中傳感器遞送效率低、信號持續(xù)性差等問題。研究團(tuán)隊(duì)通過連接能與 ATP 結(jié)合的 DNA 核酸適配體和增強(qiáng)紅色熒光的熒光核酸適配體，成功開發(fā)了適用于細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞的 GEFDA 傳感器，并實(shí)現(xiàn)了對 ATP 濃度的實(shí)時(shí)成像。
研究團(tuán)隊(duì)首先驗(yàn)證了 dimethylindole red（DIR）熒光核酸適配體（DIRFA）的穩(wěn)定性和靈敏度，并設(shè)計(jì)了基于 DIRFA 的分裂適配體（DASA）傳感器，用于 ATP 檢測。為提高信噪比和穩(wěn)定性，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開發(fā)了雙體 DASA（dDASA）傳感器，并將其編碼至質(zhì)粒中，實(shí)現(xiàn)了在細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞中的功能性表達(dá)。
dDASA 傳感器在存在 ATP 時(shí)的熒光信號強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，可精確檢測 ATP 濃度變化。在活細(xì)胞中表達(dá)GEFDA 傳感器后，課題組實(shí)現(xiàn)了在單個(gè)活細(xì)胞中追蹤 ATP 水平變化，例如通過調(diào)控細(xì)胞培養(yǎng)基中的葡萄糖或 ATP 抑制劑濃度，研究細(xì)胞代謝動態(tài)。該方法為代謝物成像提供了更穩(wěn)定、靈活的工具，可擴(kuò)展至檢測多種小分子代謝物。
圖2. 基因編碼熒光 DNA 核酸適配體在Hela細(xì)胞中實(shí)時(shí)ATP成像
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