WB-封閉和抗體孵育

1.封閉

利用惰性蛋白。非離子去污劑，或無蛋白的封閉劑來封閉膜上未被占據(jù)的位點，從而減少抗體的非特異性結(jié)合。封閉劑與膜的親和力應(yīng)高于抗體，并且不會替換膜上的目的蛋白。

通常有兩種常用的封閉劑，牛血清白蛋白（BSA）和脫脂牛奶。以下我們簡述了這兩種封閉劑使用的各自特點和i 注意事項，幫助選擇更適用于您實驗本身的封閉劑。

脫脂牛奶 :性價比高； 通常使用濃度為2.5%~5%； 不能用于磷酸化蛋白，因為脫脂奶粉中的酪蛋白本身是一種磷酸化蛋白,會結(jié)合磷酸化特異性抗體而易產(chǎn)生高背景。

牛血清蛋白（BSA）：通常使用濃度為2%~5%； 某些抗體用BSA封閉會產(chǎn)生比脫脂牛奶更強的信號，確定抗體使用的特殊需求，進行選擇適當?shù)姆忾]劑。封閉時間一般在1h，避免封閉時間過長導(dǎo)致掩蓋抗原表位，阻止抗體結(jié)合。封閉后于TBST中洗滌5 min，TBST中的吐溫-20去污劑，對抗原具有復(fù)性作用，從而提高特異性識別。

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2.抗體孵育原理

目的蛋白印跡在膜上，經(jīng)過封閉之后，印跡目的蛋白與一個或多個抗體孵育。第一個抗體（一抗）與目的蛋白結(jié)合，而第二個抗體（二抗）與第一個抗體結(jié)合，二抗本身結(jié)合有酶或染料，可用來指示蛋白的位置。不過有些一抗也具有直接標記的功能，但使用標記二抗有明顯優(yōu)勢。首先不止一個二抗分子能與單個一抗分子結(jié)合，形成信號；其次，標記的二抗可用于大量不同特異性的一抗，因而無需標記多個一抗。

3.抗體的選擇

在對于任何一種目的蛋白，都有不止一種有效抗體。為縮小選擇的范圍，我們通常要考慮以下幾個方面：

①分析或應(yīng)用類型
主要參考廠家提供的抗體數(shù)據(jù)表。有時，未說明的用途沒有列出，僅表示抗體未檢測是否具有該用途或不知道抗體如何發(fā)揮作用。

②樣品的性質(zhì)
對于樣品的性質(zhì)，我們至少要考慮以下兩方面：
a.要檢測的蛋白區(qū)域。如果要檢測的是一個蛋白片段或全長蛋白的異構(gòu)體或特定區(qū)域，那就要求選擇的抗體是由該特異片段等的免疫原刺激產(chǎn)生的。
b.樣品的處理工藝。有些抗體僅識別降解或變性蛋白，有些抗體僅識別天然蛋白抗原表位，因此要根據(jù)實驗樣品處理的具體情況選擇抗體的使用。

③抗體的種類
多克隆一抗和單克隆一抗都可以使用，但要注意，變性蛋白可能無法被天然抗原制備的抗體所識別。一般來說，用標記二抗來檢測非標記一抗時，產(chǎn)生一抗的宿主動物的類別也是不同的。在進行WB的細胞裂解液被認為不含有IgG；而組織溶解液和組織培養(yǎng)上清（含血清）被認為含IgG。在進行WB實驗時，IgG會以50和25kDa的條帶出現(xiàn)在降解和變性樣品中，分別相當于IgG的重鏈和輕鏈。 在二抗種類的選擇上，二抗應(yīng)來源于產(chǎn)生一抗的物種。

④抗體的標記和檢測
標簽結(jié)合在抗體上使抗體的結(jié)合可見，選擇標簽抗體以檢測方法的為依據(jù)進行選擇。一般推薦使用HRP標記二抗，不建議使用堿性磷酸酶（AP）標記二抗，因其不夠靈敏。

4.抗體的稀釋使用

所使用的稀釋溶劑可選擇含有低濃度封閉劑的TBST或不含有封閉劑的TBST，含有封閉劑的TBST稀釋抗體，在孵育過程中可以相應(yīng)減少非特異性吸附，避免背景過高的現(xiàn)象?？贵w稀釋溶劑TBST中一般都含有0.1%的吐溫-20去污，可防止抗體的非特異性聚集，但要知道，吐溫-20濃度高于0.05%（v/v）時，就有可能從膜上洗掉一些印跡蛋白。

按照抗體說明書建議的稀釋倍數(shù)進行稀釋使用，有時一抗和二抗的最佳濃度也取決于檢測試劑的靈敏度。一般來說，高倍稀釋一抗可減少非特異性信號，高倍稀釋酶標二抗可最大限度降低整體的高背景。

5.抗體孵育時間和溫度

一抗的孵育時間可從幾小時至過夜（一般不超過18h）不等具體取決于抗體與蛋白的親和性和蛋白的豐度。一般建議使用較高的抗體稀釋倍數(shù)結(jié)合較長的時間孵育，以保證特異性結(jié)合。若孵育時間較長應(yīng)在4℃進行。

二抗孵育在一抗結(jié)束后，TBST洗膜5min以去除殘留一抗。孵育一般在室溫下1-2h。

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6.清洗

清洗轉(zhuǎn)印膜可從膜上去除未結(jié)合的抗體或多余封閉劑，它們會導(dǎo)致高背景和檢測不佳。常用清洗緩沖液是含有吐溫-20的PBS或TBS稀釋液。如前所述，高濃度的去污劑可能會使目的蛋白從膜上洗脫。而對于高度純化抗體，往往使用不含去污劑的緩沖液進行清洗。

清洗次數(shù)和時間根據(jù)具體實驗來確定，清洗過少會產(chǎn)生過高背景；過度清洗會洗脫目的蛋白或降低信號。建議清洗3-5次，每次5min。

在TBS清洗液中添加最多0.5M的NaCl和0.2%的SDS，并將清洗延長至2h，可降低頑固背景。