CAT#:15-42900

低溫運(yùn)輸，-20℃保存

牙齦卟啉單胞菌探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒

Porphyromonas gingivalis Probe qPCR Kit

使用手冊(cè)V1.0

產(chǎn)品及特點(diǎn)

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）是一種非酵解糖的革蘭氏

陰性厭氧球桿菌，是研究廣泛且證據(jù)充足的重要牙周炎致病菌之一。它不僅可以

引發(fā)牙周炎，還能導(dǎo)致現(xiàn)在常見的抗生素抗性。它會(huì)把對(duì)牙齒有益的細(xì)菌擠走，

并取代它們的位置。牙齦卟啉單胞菌一旦失控，它最終會(huì)導(dǎo)致牙齒從牙齦上脫落

下來(lái)。國(guó)外有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn) 37%的 0-18 歲個(gè)體中均可檢測(cè)到牙齦卟啉單胞菌，

是人類健康的重大威脅。因此對(duì)牙齦卟啉單胞菌進(jìn)行快速靈敏的診斷具有重要的

意義。本產(chǎn)品就是以探針?lè)晒舛?/span> PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)牙齦卟啉

單胞菌的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)牙齦卟啉單胞菌高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他微生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為5個(gè)數(shù)量級(jí)。
6. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針?lè)晒舛?/span>PCR反應(yīng)。
7. 本產(chǎn)品只能用于科研。

格及成分

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月。

自備試劑

樣品DNA。

使用方法

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E1-10E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照。

1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同。
3. 在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號(hào)管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

7. 如果有N個(gè)樣品待提取，最好設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照）和NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢匀￡?yáng)性對(duì)照的1000倍稀釋液10μL再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規(guī)定體積一致，以此作為PC。另外用水作為NC。
8. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)DNA提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照（用第4號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：

11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR：

四、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品核酸濃度的log值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于38。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于386則為陽(yáng)性。如果在38-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽(yáng)性。

關(guān)聯(lián)產(chǎn)品

蛙病毒染料法熒光定量PCR試劑盒