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         細(xì)胞凍存是一種將細(xì)胞在低溫條件下保存的方法，目的是在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持細(xì)胞的活性和功能。這種方法對(duì)于細(xì)胞系的長(zhǎng)期保存、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性、基因庫(kù)的建立以及細(xì)胞治療的儲(chǔ)備等都具有重要意義。通過(guò)凍存，可以減少細(xì)胞在傳代過(guò)程中的遺傳變異，避免因污染、環(huán)境變化或?qū)嶒?yàn)操作失誤導(dǎo)致的細(xì)胞損失。最佳的冷凍保存時(shí)機(jī)是在細(xì)胞處于最佳生長(zhǎng)速度時(shí)。

         冷凍保護(hù)劑是細(xì)胞凍存中的關(guān)鍵成分，常用的冷凍保護(hù)劑包括二甲基亞砜（DMSO）和甘油。這些保護(hù)劑的主要作用是降低溶液的冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，從而保護(hù)細(xì)胞免受冰晶的機(jī)械損傷。DMSO是一種常用的冷凍保護(hù)劑，適用于大多數(shù)細(xì)胞類型，但某些細(xì)胞對(duì)DMSO敏感，此時(shí)可以使用甘油作為替代品。

第 1 階段   冷凍保存

實(shí)驗(yàn)步驟

1.在冷凍管上標(biāo)記日期、研究人員姓名、細(xì)胞編號(hào)、傳代數(shù)和細(xì)胞類型（以及任何其他有用信息，例如基因改造）。

2.如果是貼壁細(xì)胞，先除去細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS清洗，添加適量的胰蛋白酶以覆蓋細(xì)胞，并在37°C培養(yǎng)箱中孵育約2分鐘（具體孵育時(shí)間應(yīng)根據(jù)實(shí)際培養(yǎng)的細(xì)胞類型決定）。

         添加等量的培養(yǎng)基終止消化作用，用移液槍輕輕吹打細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞沖洗下來(lái)，并轉(zhuǎn)移到50 mL Falcon管中。

3.對(duì)于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，將所需體積的細(xì)胞直接轉(zhuǎn)移到50 mL Falcon管中。

4.使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞以確定其活力。冷凍保存的細(xì)胞活力應(yīng)至少為75%。

5.室溫下以300 × g離心5分鐘。

6.準(zhǔn)備冷凍培養(yǎng)基（見(jiàn)表1）。

         表 1. 不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞系適用的凍存培養(yǎng)基配方：

         使用前混合均勻并加熱至 37°C。

         冷凍培養(yǎng)基含有必需的冷凍保護(hù)劑，例如二甲基亞砜（DMSO），以防止形成可能損害細(xì)胞膜和成分的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外冰晶。

         注意，DMSO并不適合所有細(xì)胞類型，有些情況下，可以使用甘油作為替代品。

7.除去上清液。

8.加入凍存培養(yǎng)基至所需細(xì)胞密度。

         對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，該濃度通常為 1×106/mL 凍存液。細(xì)胞在凍存液中在室溫下放置的時(shí)間不應(yīng)超過(guò)10分鐘。

9.將1 mL樣品分裝到冷凍管中，并蓋緊蓋子。

10.將冷凍管轉(zhuǎn)移至室溫的冷凍盒中，再放入-80°C的冰箱。冷凍盒外周添加適量異丙醇，確保溫度以每分鐘1°C的速度穩(wěn)定下降。

         由于冷凍前，會(huì)有較多的水流出，因此緩慢的冷凍過(guò)程（每分鐘-1ºC）有助于防止細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。

11.約24小時(shí)后，從冷凍盒中取出冷凍管并轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

         一般冷凍的細(xì)胞可以在液氮中保存數(shù)年。理想情況下，冷凍細(xì)胞不應(yīng)在-80ºC下保存很長(zhǎng)時(shí)間（最多一周），并且應(yīng)盡快轉(zhuǎn)移到液氮中。在-80ºC下長(zhǎng)期儲(chǔ)存細(xì)胞可能會(huì)損害細(xì)胞活力。

第 2 階段   解凍冷凍細(xì)胞系

實(shí)驗(yàn)步驟

1.從液氮儲(chǔ)存器中取出冷凍管?？焖俜湃?7°C水浴中，直至解凍約80%（請(qǐng)勿在室溫下解凍）。此過(guò)程不應(yīng)超過(guò)1分鐘。

         因?yàn)榫徛慕鈨鲞^(guò)程會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損壞，所以細(xì)胞通常應(yīng)盡快解凍。

         同時(shí)，冷凍保護(hù)劑DMSO具有一定的細(xì)胞毒性，因此細(xì)胞應(yīng)以比室溫下更快的速度解凍，以便快速稀釋和去除DMSO。

         快速解凍細(xì)胞的另一個(gè)目的是防止冷凍過(guò)程中形成的任何晶體損壞細(xì)胞膜或成分。

2.使用移液器將冷凍管中的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到含有約10 mL預(yù)熱培養(yǎng)基的15 mL Falcon 管中。

3. 300 × g離心5分鐘，棄上清液，用適量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。

4.將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)容器中。然后轉(zhuǎn)移到37°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)。

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