細(xì)胞培養(yǎng)通用指南

        實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)胞，按照細(xì)胞類型劃分，大致可分為以下三類。

        （1）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞粘附于培養(yǎng)容器（例如組織培養(yǎng)塑料）。

        （2）懸浮細(xì)胞：所有細(xì)胞都隨生長(zhǎng)培養(yǎng)基懸浮生長(zhǎng)，并不附著在培養(yǎng)容器上生長(zhǎng)。

        （ 3）半貼壁細(xì)胞：一些細(xì)胞松散地粘附在培養(yǎng)容器上，另一些細(xì)胞可能懸浮在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。

        細(xì)胞也可以根據(jù)其生長(zhǎng)特性進(jìn)行分類，分為有限增殖和無限增殖：

        有限增殖：僅增殖并維持有限數(shù)量的群體倍增活力。常見的例子是直接從組織中分離的原代細(xì)胞，或在一定次數(shù)的傳代后停止生長(zhǎng)（衰老）的細(xì)胞系。

        無限增殖：具有無限分裂能力的細(xì)胞（永生化）。通常通過轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，以獲得類似癌癥的表型（例如失去接觸抑制、無限生長(zhǎng)）。

        本文我們將重點(diǎn)介紹最常見的細(xì)胞類型：貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。請(qǐng)注意：所有涉及培養(yǎng)細(xì)胞操作的程序都應(yīng)使用無菌技術(shù)和適當(dāng)?shù)目刂品椒ㄟM(jìn)行。

第 1 階段   冷凍保存

        遺傳不穩(wěn)定性在持續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞中不斷積累。因此，應(yīng)在收到細(xì)胞系后盡快將其冷凍并儲(chǔ)存。這可確保細(xì)胞庫(kù)存在遺傳上盡可能接近源材料，并降低污染風(fēng)險(xiǎn)。冷凍過程應(yīng)在有冷凍保護(hù)劑（如DMSO）的情況下以可控方式（理想情況下以每分鐘1°C的速度）冷凍細(xì)胞，以防止細(xì)胞內(nèi)形成冰晶并導(dǎo)致培養(yǎng)物活力喪失。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.使用顯微鏡觀察細(xì)胞，檢查其整體外觀，確保沒有微生物污染的跡象。同時(shí)，確保細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)階段，細(xì)胞密度不應(yīng)超過細(xì)胞系的指導(dǎo)范圍，活力一般應(yīng)大于90%。

2.按照標(biāo)準(zhǔn)傳代培養(yǎng)方法收集并計(jì)數(shù)細(xì)胞。懸浮細(xì)胞以每毫升2 - 5×106個(gè)細(xì)胞的密度凍存，貼壁細(xì)胞以每毫升1 - 2×106個(gè)細(xì)胞的密度凍存。

3.根據(jù)細(xì)胞系特點(diǎn)，選擇合適的冷凍保護(hù)劑，同時(shí)根據(jù)細(xì)胞數(shù)量計(jì)算所需的冷凍液，按照配方配置冷凍液。

        注意，如果冷凍液中添加DMSO，因DMSO添加時(shí)會(huì)釋放熱量，盡量提前配置。

4.以200 × g離心細(xì)胞懸浮液5分鐘，去除上清液，并將細(xì)胞沉淀物重新懸浮在PBS中。

5.以200 × g離心5分鐘，去除上清。

6.用配置好的冷凍液重懸細(xì)胞沉淀，充分混勻后，轉(zhuǎn)移到適當(dāng)數(shù)量的凍存管中，并標(biāo)記日期、名稱、細(xì)胞編號(hào)、傳代數(shù)和細(xì)胞類型等重要信息。

7.將凍存放入凍存盒中，在-80°C下放置一夜。這樣可以控制溫度下降。

8.轉(zhuǎn)移到液氮罐中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

第二階段   細(xì)胞復(fù)蘇

        需要使用時(shí)，應(yīng)盡快解凍細(xì)胞，以盡量減少對(duì)細(xì)胞活力的不利影響。建議在復(fù)蘇時(shí)通過離心將冷凍保存劑從培養(yǎng)基中去除。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.從液氮儲(chǔ)存中取出冷凍管并放入37°C水浴中，輕輕晃動(dòng)管子，加速解凍，仔細(xì)監(jiān)測(cè)小瓶，當(dāng)管內(nèi)解凍至黃豆大小時(shí)可將凍存管從水浴鍋中取出。

2.將凍存管內(nèi)細(xì)胞（1 ml）轉(zhuǎn)移至裝有預(yù)熱培養(yǎng)基（4 ml）的15 ml離心管中，200 - 250 × g，離心5分鐘。

        注，離心速度和時(shí)間僅供參考，可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求調(diào)整。

3.除去上清液并重新用適量預(yù)熱培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，選擇合適的接種密度，把細(xì)胞接種至相應(yīng)的培養(yǎng)容器中進(jìn)行培養(yǎng)。

4.根據(jù)細(xì)胞類型需要，添加對(duì)應(yīng)所需的生長(zhǎng)因子等成分。

第 3 階段   觀察

        應(yīng)定期用顯微鏡和肉眼觀察細(xì)胞是否有微生物污染跡象。還應(yīng)使用顯微鏡檢查來確定細(xì)胞的總體健康狀況并確定是否需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.用肉眼觀察細(xì)胞培養(yǎng)的狀態(tài)，排除污染。

        對(duì)于貼壁細(xì)胞，生長(zhǎng)培養(yǎng)基應(yīng)該是清澈的。如果不是，這可能是污染的跡象，或者細(xì)胞已經(jīng)超過匯合度并且正在死亡或從培養(yǎng)表面脫落。

        對(duì)于懸浮細(xì)胞，由于溶液中懸浮著細(xì)胞，培養(yǎng)基會(huì)更渾濁。如果渾濁度比預(yù)期的要高，再加上酸性培養(yǎng)基，可能表示存在污染或細(xì)胞密度高，需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

        溫度水平、二氧化碳和成分的代謝都會(huì)影響生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH值。

2.通過以下幾個(gè)方面，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)或是否污染等情況。

        細(xì)胞貼壁。確保細(xì)胞粘附于培養(yǎng)容器，或如預(yù)期那樣處于懸浮狀態(tài)。

        細(xì)胞形態(tài)。檢查培養(yǎng)物以確認(rèn)細(xì)胞形態(tài)符合預(yù)期。形態(tài)不同可能是污染或分化的征兆。

        融合度（針對(duì)貼壁細(xì)胞）。這是細(xì)胞覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)表面的百分比。100%表示細(xì)胞完全覆蓋培養(yǎng)容器表面。細(xì)胞需要進(jìn)行亞培養(yǎng)的百分比取決于細(xì)胞系，但最常見的是70%。

        細(xì)胞密度。通過進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)來監(jiān)測(cè)懸浮細(xì)胞的健康和生長(zhǎng)特性。收集細(xì)胞樣本并使用血球儀或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞系需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)的密度取決于細(xì)胞系。

        注意定期對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，排除支原體污染，同時(shí)在培養(yǎng)過程中，持續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞是否有細(xì)菌、真菌和酵母污染的跡象。不同的細(xì)胞系也可能污染培養(yǎng)物。

第四階段   細(xì)胞維持和傳代培養(yǎng)

        如果細(xì)胞生長(zhǎng)健康且達(dá)到了所需的匯合度，則可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)和/或接種細(xì)胞以供實(shí)驗(yàn)使用。

        如果細(xì)胞尚未達(dá)到所需的匯合度，并且自上次傳代培養(yǎng)以來已過去2-3天，則更換培養(yǎng)基并繼續(xù)，直到達(dá)到所需的匯合度。

        如果細(xì)胞出現(xiàn)污染跡象，則應(yīng)將其丟棄。

● 更換培養(yǎng)基

        培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)需要定期更換培養(yǎng)基，以防止有毒代謝物（例如乳酸）的積累，并確保生長(zhǎng)培養(yǎng)基成分的持續(xù)供應(yīng)。細(xì)胞代謝物的積累通常通過pH指示（例如酚紅）進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并以此確定完成細(xì)胞培養(yǎng)基更換的合適時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.吸取生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

        對(duì)于懸浮細(xì)胞，先將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至離心管，以200-250 × g的速度離心5分鐘，去移除培養(yǎng)基。

        對(duì)于貼壁細(xì)胞，將培養(yǎng)容器略微傾斜，直接吸出培養(yǎng)基，注意不用完全吸干凈。

2.重新添加新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

        對(duì)于懸浮細(xì)胞，用適量新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，混勻后轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)容器中。

        對(duì)于貼壁細(xì)胞，直接沿壁加入適量的新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

3.將培養(yǎng)容器及時(shí)放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，繼續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和污染跡象。

● 傳代培養(yǎng)

        如果細(xì)胞生長(zhǎng)到所需的匯合度或密度，則應(yīng)進(jìn)行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)也稱為傳代，是將細(xì)胞從之前的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)容器中，加入新鮮培養(yǎng)基，以繼續(xù)生長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.清洗并收集細(xì)胞。

        對(duì)于懸浮細(xì)胞，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至離心管，以 200-250 × g的速度離心5分鐘。除去培養(yǎng)基并將細(xì)胞沉淀物懸浮在適當(dāng)體積的PBS中，清洗一遍，離心去除PBS。

將細(xì)胞沉淀重懸于新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。

        對(duì)于貼壁細(xì)胞：

（1）將培養(yǎng)容器略微傾斜，直接吸出培養(yǎng)基，添加適當(dāng)體積的PBS清洗，確保細(xì)胞培養(yǎng)物被覆蓋，吸出并丟棄PBS。

（2）添加適當(dāng)?shù)南?，?a >胰蛋白酶，并在37°C下孵育，直至細(xì)胞分離。

（3）添加新鮮培養(yǎng)基并將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到離心管中。

（4）以200-250 × g的速度離心5分鐘。

（5）除去培養(yǎng)基并將用適當(dāng)體積的PBS重懸細(xì)胞沉淀，混勻充分清洗。

（6）以200-250 × g的速度離心5分鐘。

（7）吸出并丟棄PBS，將細(xì)胞沉淀重懸于新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。

        注意：培養(yǎng)容器所需的任何包被涂層都應(yīng)在細(xì)胞分離之前進(jìn)行。

2.選擇適合傳代稀釋比例，將適量的細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)容器中，添加生長(zhǎng)培養(yǎng)基至所需體積。

3.在培養(yǎng)容器上標(biāo)注關(guān)鍵信息，包括細(xì)胞類型、傳代次數(shù)、接種密度/分裂比、日期和操作人等。并按要求進(jìn)行孵育。

4.繼續(xù)每天監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和污染跡象。

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