在化學分析與生物檢測領域，顯色試劑DA64 - DA67的使用涵蓋了從顯色溶液的精確配制、樣本與顯色溶液的反應孵育，到吸光度檢測與結果確定等一系列嚴謹?shù)牟僮鞑襟E。只有嚴格按照這些步驟進行操作，才能充分發(fā)揮DA64 - DA67的顯色性能，為化學分析與生物檢測提供準確、可靠的數(shù)據。

一、用于常規(guī)樣本檢測的顯色溶液制備與操作 
1、顯色溶液的精確配制：在準備配制顯色溶液前，需確保實驗環(huán)境清潔，所用儀器如容量瓶、移液器等均經過校準且潔凈干燥。取4.08 mg DA67，這一質量的準確稱取是關鍵，其直接關系到最終顯色溶液的濃度準確性。將稱取好的DA67放入預先配置好的PIPES緩沖劑中，PIPES緩沖劑能為DA67提供穩(wěn)定的溶解環(huán)境，維持合適的酸堿度，保證DA67的化學性質穩(wěn)定。接著，加入1 mL濃度為100 units/mL的過氧化物酶（POD）。過氧化物酶在后續(xù)的顯色反應中扮演著關鍵的催化角色，其活性和加入量的準確性對反應進程和結果影響顯著。將上述混合物在容量瓶中用PIPES緩沖劑定容至100 mL，通過精確的定容操作，得到濃度為100 μmol/L的DA67溶液。在定容過程中，需平視容量瓶刻度線，確保溶液體積準確無誤，獲得濃度均一、穩(wěn)定的顯色溶液。

2、樣本與顯色溶液的混合反應：取上述制備好的DA67溶液3 mL，轉移至潔凈的反應容器中。同時，準備10 μL樣本溶液，樣本溶液中含有不同濃度的H?O?，濃度范圍為0 - 5 mmol/L。將樣本溶液小心加入到DA67溶液中，確保兩者充分混合。此混合過程需輕柔操作，避免產生過多氣泡，影響后續(xù)反應。 將混合后的溶液置于37°C的環(huán)境中培育5分鐘。37°C是模擬人體生理溫度的常用條件，在此溫度下，過氧化物酶能發(fā)揮最佳活性，催化DA67與H?O?之間的顯色反應。培育時間的精準控制也很重要，時間過短可能導致反應不完全，無法產生足夠的顯色效果；時間過長則可能引發(fā)副反應，干擾檢測結果。 

3、吸光度檢測與結果確定：培育完成后，使用分光光度計檢測溶液在666 nm處的吸光度。分光光度計需提前預熱并校準，確保測量數(shù)據的準確性。在測量時，需以空白溶液作為對照，空白溶液是用蒸餾水替換樣本溶液后混合而成的溶液。通過測量空白溶液的吸光度，并將其從樣本溶液的吸光度中減去，得到的吸光度差作為最終檢測值。為了確定樣本中H?O?的含量，需要預先制作校準曲線。校準曲線是通過使用已知濃度的H?O?標準溶液，按照與樣本溶液相同的操作步驟進行反應和測量吸光度，以H?O?濃度為橫坐標，吸光度差為縱坐標繪制而成。通過將樣本溶液的檢測值與校準曲線進行對比，即可準確確定樣本中的H?O?含量。

 
二、用于檢測POD活性的顯色溶液制備與操作 
1、準備另一種顯色溶液用于檢測POD活性時，同樣先確保實驗儀器的準確性和潔凈度。稱取4.08 mg DA67，加入到已配置好的Mcllvaine緩沖液中，該緩沖液的pH值為5.7，能為DA67和后續(xù)反應提供特定的酸堿環(huán)境，利于反應的進行。向其中加入1 mL濃度為2%的H?O?。H?O?在此反應體系中作為底物，與DA67在POD的催化下發(fā)生顯色反應。將上述混合物在容量瓶中用Mcllvaine緩沖液定容至100 mL，通過精確的定容操作，得到用于檢測POD活性的顯色溶液。
2、樣本與顯色溶液的孵育反應：取上述制備的顯色溶液2 mL，轉移至潔凈的反應容器中。同時，準備2 mL樣本溶液，樣本溶液中含有不同濃度的POD，濃度范圍為1 fmol - 1 pmol/tube POD。將樣本溶液與顯色溶液充分混合，輕柔攪拌，保證兩者均勻接觸。將混合后的溶液在37°C下孵育。在此溫度下，POD能夠催化DA67與H?O?之間的顯色反應，使溶液顏色發(fā)生變化。孵育過程需保持環(huán)境溫度穩(wěn)定，避免溫度波動影響POD的活性和反應進程。 
3、吸光度檢測與POD活性確定：孵育結束后，使用分光光度計檢測溶液在666 nm處的吸光度。同樣，需以空白溶液作為對照，減去空白溶液的吸光度后，得到的吸光度差作為檢測值。預先制作用于檢測POD活性的校準曲線，該曲線是通過使用已知濃度的POD標準溶液，按照與樣本溶液相同的操作步驟進行反應和測量吸光度，以POD濃度為橫坐標，吸光度差為縱坐標繪制而成。通過將樣本溶液的檢測值與校準曲線進行對比，即可準確確定樣本中的POD活性數(shù)值。

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