循環(huán)性缺氧已被認(rèn)為是多種肝臟疾病的典型特征，其實(shí)時(shí)成像對(duì)于更好地了解其生物學(xué)功能具有重要意義。例如肝臟缺血再灌注(HIR)是肝臟外科手術(shù)如肝臟移植、肝部分切除等過(guò)程中經(jīng)常遇到的生理現(xiàn)象，肝缺血是通過(guò)動(dòng)脈夾夾住小鼠的肝動(dòng)脈和門(mén)靜脈以導(dǎo)致約 70％的肝臟血流被剝奪，從而導(dǎo)致肝臟為乏氧狀態(tài)，再灌注過(guò)程是將鉗夾從血管上釋放出來(lái)以恢復(fù)血液供應(yīng)，從而導(dǎo)致肝臟為復(fù)氧狀態(tài)。近年來(lái)，文獻(xiàn)報(bào)道了多例用于診斷肝臟乏氧的敏感型熒光探針，并進(jìn)一步將熒光成像與光聲成像相結(jié)合，以高靈敏度和高組織穿透深度的特點(diǎn)可視化細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。然而，大多數(shù)乏氧探針是不可逆的，換言之，探針一旦響應(yīng)乏氧環(huán)境將始終保持熒光“開(kāi)啟”狀態(tài)，不再實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)氧氣壓力(pO2)變化，這不可避免地導(dǎo)致“假陽(yáng)性”信號(hào)。因此，目前尚缺乏有效的光學(xué)探針用于肝臟循環(huán)乏氧的可逆性檢測(cè)。

圖1. 探針AzoCy-CF3可逆性檢測(cè)“乏氧-常氧”的反應(yīng)機(jī)制及在肝臟缺血再灌注和非酒精性脂肪肝模型中的應(yīng)用 (圖片來(lái)源：CCS Chemistry)

    近期，南京大學(xué)郭子建院士/陳韻聰教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一例新穎的近紅外乏氧可逆探針AzoCy-CF3，如圖1所示，它由熒光報(bào)告單元硫雜蒽部花菁和乏氧識(shí)別基團(tuán)雙三氟甲基芳環(huán)偶氮組成。該探針由于偶氮鍵的快速異構(gòu)化而淬滅熒光，在乏氧狀態(tài)下，偶氮鍵還原為肼鍵并伴隨吸收波長(zhǎng)紅移，760 nm 處熒光增強(qiáng)96.3倍。AzoCy-CF3探針在體外溶液和細(xì)胞中都表現(xiàn)出“乏氧-復(fù)氧”環(huán)境下的循環(huán)可逆成像，且在肝正常L02和肝癌 HepG2 細(xì)胞乏氧狀態(tài)下表現(xiàn)出較高的氧含量敏感性，并成功應(yīng)用于荷HepG2小鼠腫瘤的乏氧監(jiān)測(cè)。進(jìn)一步將探針AzoCy-CF3應(yīng)用于肝臟缺血再灌注(HIR)模型中，實(shí)時(shí)“可逆性”跟蹤 HIR 過(guò)程，即在缺血時(shí)近紅外熒光/光聲(NIRF/PA)信號(hào)增強(qiáng)，再灌注時(shí)NIRF/PA信號(hào)減弱，如此循環(huán)往復(fù)。此外，該探針成功可視化了非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型中慢性肝臟乏氧的程度，并在體內(nèi)評(píng)估了各種保肝藥物對(duì)NAFLD的治療效果。這種高效的NIRF/PA可逆型探針為建立一個(gè)專(zhuān)門(mén)用于診斷和監(jiān)測(cè)乏氧相關(guān)性肝臟疾病的平臺(tái)提供了一個(gè)強(qiáng)大而可靠的成像工具。相關(guān)研究成果發(fā)表在CCS Chemistry (DOI: 10.31635/ccschem.024.202404092）。

急性/慢性肝損傷的乏氧可逆雙模式成像

    如圖2所示，AzoCyS-CF3本身吸收峰在625 nm附近，乏氧處理后吸收峰紅移至725 nm，達(dá)到光聲成像窗口。AzoCyS-CF3初始態(tài)由于偶氮鍵作用而熒光淬滅，乏氧處理后其760 nm 處的熒光顯著增強(qiáng)；隨后將該測(cè)試液放置于常氧空氣中，發(fā)現(xiàn)其熒光又發(fā)生了淬滅，再補(bǔ)加小鼠肝微粒體(內(nèi)含偶氮還原酶)和NADPH (還原性輔酶)后，熒光重新打開(kāi)；如此數(shù)次循環(huán)后探針實(shí)現(xiàn)了“常氧-乏氧-常氧”條件下熒光“關(guān)-開(kāi)-關(guān)”的可逆響應(yīng)，光聲信號(hào)也實(shí)現(xiàn)了類(lèi)似的變化。AzoCyS-CF3的可逆行為是因?yàn)樘结樀呐嫉I被還原后停留在第一步的苯肼結(jié)構(gòu)，而兩個(gè)吸電子基三氟甲基可以穩(wěn)定苯肼?tīng)顟B(tài)，使其不會(huì)繼續(xù)被還原，在氧氣存在時(shí)，苯肼將電子傳遞給氧氣，自身被氧化成初始態(tài)偶氮鍵。同時(shí)，熒光強(qiáng)度-時(shí)間曲線(xiàn)圖表明該響應(yīng)平衡時(shí)間為20分鐘且增強(qiáng)幅度達(dá)到 96.3 倍，相比之前的工作在光譜響應(yīng)性能上有很大的進(jìn)步。

圖2. 探針AzoCyS-CF3可逆響應(yīng)“乏氧-復(fù)氧”環(huán)境的NIRF/PA光譜圖 (圖片來(lái)源：CCS Chemistry)

    據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤組織是常見(jiàn)的乏氧環(huán)境，其原因是腫瘤細(xì)胞快速地生長(zhǎng)，消耗氧氣和其他養(yǎng)分，而內(nèi)部血管的生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，導(dǎo)致血流量減少，供氧能力大大削弱，使得局部腫瘤組織形成乏氧區(qū)域。如圖3所示，在活體腫瘤模型中研究了探針AzoCyS-CF3在體內(nèi)的乏氧識(shí)別性能。熒光成像顯示左側(cè)皮下注射組熒光略有增強(qiáng)，而右側(cè)瘤內(nèi)注射組熒光在1 h內(nèi)大幅度增強(qiáng)至3.7倍，且從小鼠全身圖中也能看出熒光信號(hào)強(qiáng)弱的明顯差異。這表明 AzoCyS-CF3可以在腫瘤部位乏氧環(huán)境特異性激活。進(jìn)一步采集左側(cè)皮下和右側(cè)腫瘤的 730 nm處光聲信號(hào)，由圖可見(jiàn)，腫瘤中光聲信號(hào)顯著增強(qiáng)，而皮下注射組的信號(hào)幾乎沒(méi)有明顯變化，通過(guò) 3D 重建獲得三維組織圖像，再將三維圖沿 X 軸進(jìn)行分割，得到一系列的組織深度成像圖?？梢钥闯鲈诮】档钠は陆M織中，隨著組織深度的變化，PA730 光聲信號(hào)幾乎沒(méi)有變化，說(shuō)明正常組織沒(méi)有乏氧的特征。相比之下，腫瘤中的光聲信號(hào)強(qiáng)烈且主要集中在內(nèi)部，腫瘤邊緣的信號(hào)較弱，說(shuō)明實(shí)體瘤中氧含量分布高度不均勻，其內(nèi)部由于血管供氧速度遠(yuǎn)低于腫瘤生長(zhǎng)速度而導(dǎo)致嚴(yán)重乏氧。以上方法和結(jié)果表明 AzoCyS-CF3可以精確區(qū)分腫瘤乏氧異質(zhì)化，為可視化測(cè)定乏氧程度和輔助癌癥治療提供有力的分子工具。

圖3. 探針AzoCyS-CF3用于腫瘤乏氧熒光/光聲雙模式成像 (圖片來(lái)源：CCS Chemistry)

    肝臟缺血再灌注(HIR)是肝臟外科手術(shù)過(guò)程中經(jīng)常遇到的生理現(xiàn)象，該行為會(huì)產(chǎn)生高度的氧化應(yīng)激和典型的急性肝損傷，同時(shí)這種缺血-供血過(guò)程無(wú)法避免地導(dǎo)致肝臟經(jīng)受循環(huán)乏氧-復(fù)氧歷程。探針AzoCyS-CF3具有肝臟代謝和保留的能力，選取在尾靜脈注射探針2 h后進(jìn)行HIR 手術(shù)并跟蹤成像(λex: 740 nm，λem: 790 nm±20 nm)，且整個(gè)過(guò)程在三個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，這樣可避免由代謝和濃度引起的熒光變化。如圖4所示，尾靜脈注射 AzoCyS-CF3后 2 h，立即手術(shù)缺血，以注射后2 h為零點(diǎn)，熒光強(qiáng)度在前20分鐘迅速增強(qiáng)至2.5倍，并在接下來(lái)的20 分鐘內(nèi)保持不變；40分鐘后去掉動(dòng)脈夾，恢復(fù)血液供應(yīng)，此時(shí)熒光強(qiáng)度迅速降低，20分鐘后降低至最低值并幾乎變化。以注射后2 h為零點(diǎn)，整個(gè)熒光變化過(guò)程可以總結(jié)為：增強(qiáng)(缺血開(kāi)始，前 20 min)-平臺(tái)(20 min~40 min)-降低(灌注開(kāi)始，40 min~60 min)-平臺(tái)(60 min~80 min)，光聲信號(hào)亦達(dá)到了類(lèi)似的響應(yīng)。因此，探針AzoCyS-CF3能實(shí)時(shí)跟蹤HIR手術(shù)中乏氧-復(fù)氧過(guò)程，且響應(yīng)時(shí)間為20分鐘，具有手術(shù)導(dǎo)航的潛在作用。

圖4. 探針AzoCyS-CF3用于肝臟缺血再灌注模型中熒光/光聲雙模式成像 (圖片來(lái)源：CCS Chemistry)

    非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是目前全球最常見(jiàn)的慢性肝病，可從肝臟脂肪變性發(fā)展到肝硬化。在高脂飲食(HFD)的小鼠中，慢性缺氧已被確定與NAFLD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，然而，目前很少有研究通過(guò)監(jiān)測(cè)體內(nèi)乏氧程度來(lái)評(píng)估保肝藥物的療效。如圖5所示，根據(jù)不同的結(jié)構(gòu)類(lèi)型篩選了6種保肝藥物，即奧貝膽酸(OCA)，奧利司他(ollistat)，己酮可可堿(PTX)，N-乙酰半胱氨酸(NAC)，硫辛酸(α-LA)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，用以研究探針在 NAFLD小鼠模型的乏氧程度雙模式成像來(lái)評(píng)估其療效。按照標(biāo)準(zhǔn)程序，用HFD喂養(yǎng)小鼠8周，建立 NAFLD 動(dòng)物模型。隨后將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC)、HFD組(HFD組)和康復(fù)組(分別給予6種藥物飲食)。通過(guò)尾靜脈給小鼠注射AzoCys-CF3，并進(jìn)行時(shí)間依賴(lài)性熒光成像，研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于HFD小鼠組，肝臟區(qū)的熒光信號(hào)比NC組強(qiáng)約2.6倍，而康復(fù)組表現(xiàn)出比HFD 組更弱的熒光信號(hào)。顯然，SAM組和OLST組的肝熒光下降較為明顯，分別比HFD組低42%和54%。從不同小鼠組獲得的主要解剖器官的熒光圖像與體內(nèi)熒光圖像一致。光聲信號(hào)的變化趨勢(shì)與熒光成像結(jié)果一致。并且可通過(guò)血清生化標(biāo)志物如谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，γ-谷氨酰胺酰基轉(zhuǎn)移酶(γ-GGT)和肝臟H&E染色組織病理學(xué)檢查來(lái)評(píng)估肝損傷程度，這些生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果與利用乏氧水平作為生物標(biāo)志物的體內(nèi) NIRF/PA 成像的表現(xiàn)非常一致。這些結(jié)果證實(shí) AzoCys-CF3可作為一種有效的NIRF/PA雙重成像試劑，用于監(jiān)測(cè)慢性肝缺氧和評(píng)估保肝藥物對(duì)NAFLD的治療效果。

圖5. 探針AzoCyS-CF3用于NAFLD小鼠慢性缺氧模型的體內(nèi)檢測(cè)及藥物保肝作用的評(píng)價(jià) (圖片來(lái)源：CCS Chemistry)

    該工作提供了一例可靠的雙模式成像試劑AzoCyS-CF3，用以可視化肝臟循環(huán)缺氧歷程和慢性肝疾病康復(fù)評(píng)估，這對(duì)研究循環(huán)乏氧相關(guān)性疾病的病理進(jìn)展具有重要意義。

相關(guān)研究成果發(fā)表在CCS Chemistry (DOI: 10.31635/ccschem.024.202404092），南京大學(xué)博士后姚善昆為第一作者，郭子建教授、陳韻聰教授為通訊作者。詳見(jiàn)：Shankun Yao, Zelong Wu, Yuming Zhang, Tao Yang, Hao Yuan, Weizhong Ding, Weijiang He, and Zijian Guo* & Yuncong Chen*. Dual mode reversible imaging of the hypoxia status of acute and chronic hepatic injury. DOI: 10.31635/ccschem.024.202404092.

轉(zhuǎn)載鏈接：南京大學(xué)郭子建/陳韻聰教授團(tuán)隊(duì)：急性/慢性肝損傷的乏氧可逆雙模式成像 (qq.com)

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