背景^[1-3]

USF1抗體是一種可以特異性結合PDX1的人工合成抗體，可以靶向結合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的PDX1蛋白。USF1抗體可用于多種科學應用，包括Western Blot、免疫組織化學、免疫細胞化學、免疫沉淀和ELISA。

上游刺激因子1（USF1），也稱為B類堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白11。它是一種主要的晚期轉錄因子1.USF1是堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈家族的成員，可以作為細胞轉錄因子發(fā)揮作用。編碼的蛋白質可以通過富含嘧啶的起始（Inr）元件和E盒基序激活轉錄。USF1與家族性聯合高脂血癥（FCHL）有關。USF1存在兩種亞型，計算的USF1分子量為32 kDa和27 kDa。USF1具有乙?；问胶土姿峄问?，因此USF1的分子量可以遷移到約40 kDa。

USF1抗體

USF1抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預制膠，將預制膠固定在電泳槽中，內槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。

3.轉膜與封閉

1）將膠浸于預冷的轉膜緩沖液中平衡5min。

2）依據膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預冷的轉膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預冷的轉膜緩沖液中。

3）裝配轉移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉膜結束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（USF1抗體按照產品應用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(USF1抗體)。

3）將膜和二抗（按照產品應用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應用^[4][5]

USF1抗體可以用于USF1下調結直腸癌中FHL2基因轉錄調控的機制研究

探討USF1在結直腸癌發(fā)生中的作用及其對FHL2基因的轉錄調控作用與機制。研究內容

方法:一、利用RT-PCR和USF1抗體Western blot方法檢測不同的人胃腸道腫瘤細胞中USF1的表達情況;二、利用USF1抗體免疫組化方法檢測不同分期的人結直腸腫瘤組織中USF1的表達情況;三、利用EMSA和ChIP方法檢測USF1蛋白與FHL2基因啟動子的結合情況;四、利用基因克隆技術構建FHL2啟動子的真核表達載體,利用定點突變技術構建FHL2啟動子的突變載體;五、利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測定點突變FHL2啟動子的E-box位點后,突變載體熒光素酶活性的變化;六、利用基因克隆技術構建并鑒定重組質粒pcDNA3.1（+）-USF1;七、利用RT-PCR和USF1抗體Western blot方法檢測過表達或者干擾USF1后FHL2的表達情況;八、利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測過表達或者干擾USF1后FHL2啟動子的熒光素酶活性。

USF1抗體結果:一、USF1在不同的人胃腸道腫瘤細胞株中具有不同的表達水平8株人胃腸道腫瘤細胞均表達USF1蛋白。USF1在蛋白水平的表達量以SW480、SW620和LoVo細胞最高,而在KATOⅢ細胞中的含量最低;USF1在mRNA水平的表達量以SW480、SW620、LoVo和HCT116細胞最高,而在KATOⅢ細胞中的含量最低。二、USF1在人結直腸腫瘤組織的表達顯著增強USF1在人正常結直腸黏膜中蛋白呈低表達;在有不典型增生的人腺瘤組織中,USF1的表達相對于正常人結直腸黏膜開始增強;而在人結直腸癌組織中其表達顯著增強,差別有統(tǒng)計學意義（P=0.0018）。USF1蛋白的表達在不同Dukes'分期、不同分化程度的結直腸癌組織之間無明顯差異（P＞0.05）。三、USF1對FHL2基因的轉錄具有調控作用1、USF1能夠與FHL2啟動子的上游E-box位點特異性結合EMSA實驗證實了SW480細胞的核蛋白與-817bp/-812bp處E-box位點結合形成了DNA-核蛋白復合物,且競爭性探針可以抑制此復合物的形成。ChIP實驗證實了SW480細胞中USF1蛋白能與FHL2基因DNA結合。2、定點突變FHL2啟動子的E-box位點后,突變載體的熒光素酶活性較未突變組明顯升高雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)證實在SW480細胞和LoVo細胞中4個FHL2基因啟動子報告載體的轉錄活性不同,其中pluc595的熒光素酶活性值最高。對FHL2啟動子區(qū)域-817/-812bp處的E-box進行定點突變,使其由CAGCTG序列變?yōu)門AATTG,從而破壞E-box位點的序列,使其不能與USF1結合。定點突變FHL2啟動子后,突變載體熒光素酶活性較未突變組明顯升高（p＜0.05）。3、構建重組質粒pcDNA3.1（+）-USF1,并篩選出USF1高表達的SW480細胞和LoVo細胞,將其命名為SW480USF1和LoVoUSF1。4、在SW480USF1和LoVoUSF1中,FHL2表達水平顯著降低（P＜0.05）。5、在SW480細胞和LoVo細胞中采用USF1 siRNA干擾USF1的表達后,FHL2表達水平顯著增高（P＜0.05）。6、在SW480USF1和LoVoUSF1中,FHL2基因啟動子的轉錄活性下降。7、在SW480細胞和LoVo細胞中,采用USF1 siRNA干擾USF1的表達后,FHL2基因啟動子的轉錄活性上調。

參考文獻

[1]Suppression of FHL2 Expression Induces Cell Differentiation and Inhibits Gastric and Colon Carcinogenesis[J].Jide Wang;;Yi Yang;;Harry H.X.Xia;;Qing Gu;;Marie C.M.Lin;;Bo Jiang;;Ying Peng;;Guoqing Li;;Xiaomeng An;;Yali Zhang;;Zehao Zhuang;;Zhenshu Zhang;;Hsiang Fu Kung;;Benjamin C.Y.Wong.Gastroenterology,2007(3)

[2]FHL2 interacts with both ADAM‐17 and the cytoskeleton and regulates ADAM‐17 localization and activity[J].MatthiasCanault;EdwigeTellier;BernadetteBonardo;EricMas;MoniqueAumailley;IrèneJuhan‐Vague;GillesNalbone;FranckPeiretti.J.Cell.Physiol.,2006(2)

[3]The SRF Target Gene Fhl2 Antagonizes RhoA/MAL-Dependent Activation of SRF[J].Ulrike Philippar;;Gerhard Schratt;;Christoph Dieterich;;Judith M.Müller;;Petra Galgóczy;;Felix B.Engel;;Mark T.Keating;;Frank Gertler;;Roland Schüle;;Martin Vingron;;Alfred Nordheim.Molecular Cell,2004(6)

[4]Recruitment of Histone Modifications by USF Proteins at a Vertebrate Barrier Element[J].Adam G.West;;Suming Huang;;Miklos Gaszner;;Michael D.Litt;;Gary Felsenfeld.Molecular Cell,2004(3)

[5]張艷.USF1下調結直腸癌中FHL2基因轉錄調控的機制研究[D].南方醫(yī)科大學,2009.