背景^[1-3]

USF1抗體是一種可以特異性結(jié)合PDX1的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的PDX1蛋白。USF1抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

上游刺激因子1（USF1），也稱為B類堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白11。它是一種主要的晚期轉(zhuǎn)錄因子1.USF1是堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈家族的成員，可以作為細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。編碼的蛋白質(zhì)可以通過富含嘧啶的起始（Inr）元件和E盒基序激活轉(zhuǎn)錄。USF1與家族性聯(lián)合高脂血癥（FCHL）有關(guān)。USF1存在兩種亞型，計(jì)算的USF1分子量為32 kDa和27 kDa。USF1具有乙?；问胶土姿峄问剑虼薝SF1的分子量可以遷移到約40 kDa。

USF1抗體

USF1抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（USF1抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(USF1抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

USF1抗體可以用于USF1下調(diào)結(jié)直腸癌中FHL2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制研究

探討USF1在結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用及其對(duì)FHL2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用與機(jī)制。研究?jī)?nèi)容

方法:一、利用RT-PCR和USF1抗體Western blot方法檢測(cè)不同的人胃腸道腫瘤細(xì)胞中USF1的表達(dá)情況;二、利用USF1抗體免疫組化方法檢測(cè)不同分期的人結(jié)直腸腫瘤組織中USF1的表達(dá)情況;三、利用EMSA和ChIP方法檢測(cè)USF1蛋白與FHL2基因啟動(dòng)子的結(jié)合情況;四、利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建FHL2啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體,利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建FHL2啟動(dòng)子的突變載體;五、利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)定點(diǎn)突變FHL2啟動(dòng)子的E-box位點(diǎn)后,突變載體熒光素酶活性的變化;六、利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建并鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-USF1;七、利用RT-PCR和USF1抗體Western blot方法檢測(cè)過表達(dá)或者干擾USF1后FHL2的表達(dá)情況;八、利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)過表達(dá)或者干擾USF1后FHL2啟動(dòng)子的熒光素酶活性。

USF1抗體結(jié)果:一、USF1在不同的人胃腸道腫瘤細(xì)胞株中具有不同的表達(dá)水平8株人胃腸道腫瘤細(xì)胞均表達(dá)USF1蛋白。USF1在蛋白水平的表達(dá)量以SW480、SW620和LoVo細(xì)胞最高,而在KATOⅢ細(xì)胞中的含量最低;USF1在mRNA水平的表達(dá)量以SW480、SW620、LoVo和HCT116細(xì)胞最高,而在KATOⅢ細(xì)胞中的含量最低。二、USF1在人結(jié)直腸腫瘤組織的表達(dá)顯著增強(qiáng)USF1在人正常結(jié)直腸黏膜中蛋白呈低表達(dá);在有不典型增生的人腺瘤組織中,USF1的表達(dá)相對(duì)于正常人結(jié)直腸黏膜開始增強(qiáng);而在人結(jié)直腸癌組織中其表達(dá)顯著增強(qiáng),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0018）。USF1蛋白的表達(dá)在不同Dukes'分期、不同分化程度的結(jié)直腸癌組織之間無明顯差異（P＞0.05）。三、USF1對(duì)FHL2基因的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用1、USF1能夠與FHL2啟動(dòng)子的上游E-box位點(diǎn)特異性結(jié)合EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SW480細(xì)胞的核蛋白與-817bp/-812bp處E-box位點(diǎn)結(jié)合形成了DNA-核蛋白復(fù)合物,且競(jìng)爭(zhēng)性探針可以抑制此復(fù)合物的形成。ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SW480細(xì)胞中USF1蛋白能與FHL2基因DNA結(jié)合。2、定點(diǎn)突變FHL2啟動(dòng)子的E-box位點(diǎn)后,突變載體的熒光素酶活性較未突變組明顯升高雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證實(shí)在SW480細(xì)胞和LoVo細(xì)胞中4個(gè)FHL2基因啟動(dòng)子報(bào)告載體的轉(zhuǎn)錄活性不同,其中pluc595的熒光素酶活性值最高。對(duì)FHL2啟動(dòng)子區(qū)域-817/-812bp處的E-box進(jìn)行定點(diǎn)突變,使其由CAGCTG序列變?yōu)門AATTG,從而破壞E-box位點(diǎn)的序列,使其不能與USF1結(jié)合。定點(diǎn)突變FHL2啟動(dòng)子后,突變載體熒光素酶活性較未突變組明顯升高（p＜0.05）。3、構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-USF1,并篩選出USF1高表達(dá)的SW480細(xì)胞和LoVo細(xì)胞,將其命名為SW480USF1和LoVoUSF1。4、在SW480USF1和LoVoUSF1中,FHL2表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。5、在SW480細(xì)胞和LoVo細(xì)胞中采用USF1 siRNA干擾USF1的表達(dá)后,FHL2表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05）。6、在SW480USF1和LoVoUSF1中,FHL2基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性下降。7、在SW480細(xì)胞和LoVo細(xì)胞中,采用USF1 siRNA干擾USF1的表達(dá)后,FHL2基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)。

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