背景^[1-3]

PDE4C抗體是一種可以特異性結(jié)合PDE4C的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的PDE4C蛋白。PDE4C抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

PDE4C蛋白質(zhì)屬于環(huán)核苷酸磷酸二酯酶（PDE）家族和PDE4亞家族。這種PDE水解第二個(gè)信使cAMP，cAMP是許多細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外信號(hào)反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子和介質(zhì)。因此，通過調(diào)節(jié)cAMP的細(xì)胞濃度，這種蛋白質(zhì)在許多重要的生理過程中起關(guān)鍵作用。已經(jīng)為該基因描述了編碼不同亞型的可變剪接轉(zhuǎn)錄物變體。

PDE4C抗體

PDE4C抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說(shuō)明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（PDE4C抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(PDE4C抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說(shuō)明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

PDE4C抗體可以用于磷酸二酯酶4調(diào)節(jié)固有細(xì)胞功能參與血管重塑疾病的機(jī)制和干預(yù)研究

探究PDE4亞家族成員在心肺血管疾病中的作用及其機(jī)制。

方法與結(jié)果:前期實(shí)驗(yàn)室PDE4C抗體研究發(fā)現(xiàn)PDE4B在PH肺組織中表達(dá)上調(diào),且主要表達(dá)在肺血管EC。(1)通過條件性基因敲除小鼠構(gòu)建PH模型并進(jìn)行疾病表型檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)EC中PDE4B缺失能夠明顯改善小鼠的PH病變,并且發(fā)現(xiàn)PDE4B與疾病中EC的增殖有關(guān);(2)體外通過在小鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(mPAEC)中進(jìn)行PDE4B敲低和PDE4抑制劑給藥實(shí)驗(yàn),PDE4C抗體結(jié)果發(fā)現(xiàn)mPAEC中PDE4B缺失或PDE4被抑制能夠明顯抑制低氧刺激誘導(dǎo)的mPAEC增殖和遷移;(3)通過在大鼠構(gòu)建PH模型并給予PDE4B抑制劑治療,發(fā)現(xiàn)PDE4B特異性抑制能夠顯著改善大鼠的PH病變。前期實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)PDE4D在高血壓血管組織中表達(dá)增加,且體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)SMC收縮。(1)通過條件性基因敲除小鼠和給予PDE4抑制劑治療并進(jìn)行血管環(huán)張力檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)SMC中PDE4D缺失或全身性PDE4抑制能夠明顯改善高血壓小鼠的阻力血管收縮異常。(2)通過對(duì)PDE4D下游信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證,我們發(fā)現(xiàn)在高血壓中PDE4D可通過PKA/AMPK-MYPT1/MLC信號(hào)通路增強(qiáng)SMC的收縮,導(dǎo)致阻力血管收縮異常。研究結(jié)論:PDE4亞家族的PDE4B可通過促進(jìn)EC的增殖和遷移來(lái)參與PH,而PDE4D可通過促進(jìn)SMC的收縮舒張異常來(lái)參與高血壓,給予PDE4亞型特異性抑制劑可能是血管重塑疾病的潛在治療方法。

參考文獻(xiàn)

[1]2022 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension.[J].Humbert Marc;Kovacs Gabor;Hoeper Marius M;Badagliacca Roberto;Berger Rolf M F;Brida Margarita;Carlsen J?rn;Coats Andrew J S;EscribanoSubias Pilar;Ferrari Pisana;Ferreira Diogenes S;Ghofrani Hossein Ardeschir;Giannakoulas George;Kiely David G;Mayer Eckhard;Meszaros Gergely;Nagavci Blin;Olsson Karen M;PepkeZaba Joanna;Quint Jennifer K;R?degran G?ran;Simonneau Gerald;Sitbon Olivier;Tonia Thomy;Toshner Mark;Vachiery JeanLuc;Vonk Noordegraaf Anton;Delcroix Marion;Rosenkranz Stephan.The European respiratory journal.2022

[2]Pulmonary vascular disease in pulmonary hypertension due to left heart disease:pathophysiologic implications.[J].Omote Kazunori;Sorimachi Hidemi;Obokata Masaru;Reddy Yogesh N V;Verbrugge Frederik H;Omar Massar;DuBrock Hilary M;Redfield Margaret M;Borlaug Barry A.European heart journal.2022

[3]Trial of a Preferential Phosphodiesterase 4B Inhibitor for Idiopathic Pulmonary Fibrosis.[J].Richeldi Luca;Azuma Arata;Cottin Vincent;Hesslinger Christian;Stowasser Susanne;Valenzuela Claudia;Wijsenbeek Marlies S;Zoz Donald F;Voss Florian;Maher Toby M.The New England journal of medicine.2022

[4]BI 1015550 is a PDE4B Inhibitor and a Clinical Drug Candidate for the Oral Treatment of Idiopathic Pulmonary Fibrosis[J].Herrmann Franziska Elena;Hesslinger Christian;Wollin Lutz;Nickolaus Peter.Frontiers in Pharmacology.2022

[5]侯楊峰.磷酸二酯酶4調(diào)節(jié)固有細(xì)胞功能參與血管重塑疾病的機(jī)制和干預(yù)研究[D].北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2023.