背景^[1-3]

PYK2抗體是一種IgG2bκ小鼠單克隆p-PYK2抗體，它通過(guò)蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀、免疫熒光、免疫組織化學(xué)（P）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)人源Tyr 402磷酸化的PYK2。p-PYK2抗體（13.Tyr 402）既有偶聯(lián)形式，也有非偶聯(lián)形式的抗p-PYK2抗體。PYK2（富含脯氨酸的酪氨酸激酶2）是FAK家族的假定成員，在其激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)與FAK具有61%的序列同一性。與FAK一樣，PYK2已被證明是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白酪氨酸激酶，它是pp60Src的內(nèi)在蛋白酪氨酸激酶活性的底物。PYK2（也稱為CAKb或RAFTK）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)。PYK2在酪氨酸殘基上迅速磷酸化以響應(yīng)刺激，從而增加細(xì)胞內(nèi)鈣水平，進(jìn)而激活PKC家族激酶的成員。具體來(lái)說(shuō)，PYK2在刺激后的Tyr 402上被磷酸化。這促進(jìn)了介導(dǎo)Src對(duì)p190 RhoGAP磷酸化的多蛋白復(fù)合物的形成。PYK2激酶的激活導(dǎo)致離子通道功能的調(diào)節(jié)和MAPK信號(hào)通路的激活。PYK2還在激活環(huán)內(nèi)的Tyr 579和Tyr 580以及潛在Grb2結(jié)合位點(diǎn)上的Tyr 881處含有磷酸化位點(diǎn)。

PYK2抗體

PYK2抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過(guò)37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開(kāi)電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開(kāi)硅膠，即可打開(kāi)玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說(shuō)明書(shū)，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒(méi)在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（PYK2抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(PYK2抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說(shuō)明書(shū)，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

PYK2抗體可以用于酪氨酸激酶Pyk2在大鼠和小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中的定位和功能研究

利用PYK2抗體蛋白質(zhì)免疫印跡的方法首次檢測(cè)到Pyk2和第402位酪氨酸殘基磷酸化的Pyk2（Tyr402p-Pyk2）的表達(dá)。免疫熒光化學(xué)定位的研究發(fā)現(xiàn),在生發(fā)泡期（GV期）的大鼠卵母細(xì)胞中Pyk2和Tyr402p-Pyk2定位于卵皮質(zhì)區(qū)及細(xì)胞核周圍的卵胞質(zhì)中,Pyk2還存在于生發(fā)泡中。生發(fā)泡破裂（germinal vesicle breakdown,GVBD）后,Pyk2及Tyr402p-Pyk2分布在卵皮質(zhì)和染色體周圍的細(xì)胞質(zhì)中。減數(shù)分裂后期和第二次減數(shù)分裂中期的定位相似,Pyk2和p-Pyk2分布在細(xì)胞質(zhì)中和皮質(zhì)區(qū),在減數(shù)分裂紡錘體周圍及其定位的皮質(zhì)區(qū)有更多的Pyk2和p-Pyk2聚集。第一次減數(shù)分裂的末期,除了胞質(zhì)中和皮質(zhì)區(qū)的定位外,大量Pyk2和p-Pyk2集中在卵裂溝的位置。利用PYK2抗體和p-Pyk2抗體共同標(biāo)記的方法研究發(fā)現(xiàn),Pyk2或p-Pyk2與微絲在大鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟的多個(gè)階段存在共定位現(xiàn)象。另外,向GV期卵母細(xì)胞中注射抗Pyk2抗體破壞了微絲的聚集并抑制了第一極體的排放,使減數(shù)分裂發(fā)生阻滯。這些結(jié)果表明Pyk2在大鼠卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中表達(dá),并活化,可能參與了微絲組裝調(diào)節(jié),對(duì)大鼠卵母細(xì)胞極性的確立、第一極體的排出具有重要的作用。

應(yīng)用Pyk2抗體免疫熒光化學(xué)方法研究小鼠卵母細(xì)胞發(fā)現(xiàn),剛從卵泡中釋放出的GV期小鼠卵母細(xì)胞中,Pyk2在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中及除核仁以外的細(xì)胞核中均勻分布,在體外培養(yǎng)的過(guò)程中,Pyk2逐漸向細(xì)胞核中集中,發(fā)生GVBD前,Pyk2分布在開(kāi)始凝集的染色體上。GVBD后,直至整個(gè)MII期,Pyk2都均勻地分布在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中。Tyr402p-Pyk2在剛從體內(nèi)取出的GV期卵母細(xì)胞中不表達(dá),直到體外培養(yǎng)1小時(shí)后才發(fā)現(xiàn)p-Pyk2分布在除了核仁外的整個(gè)卵母細(xì)胞中,GVBD后至第二次減數(shù)分裂中期,p-Pyk2始終均勻分布在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中。對(duì)Pyk2在受精卵中亞細(xì)胞定位的研究發(fā)現(xiàn),無(wú)論是體內(nèi)受精還是體外受精,在精子穿入引發(fā)的第二次減數(shù)分裂后期,Pyk2比較均勻地分布在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中。在排出第二極體和雄原核形成的過(guò)程中,Pyk2除了在受精卵細(xì)胞質(zhì)中分布外,還與精子頭部的染色體密切相關(guān)。雌雄原核融合形成合子時(shí),Pyk2又定位在合子的細(xì)胞核中。為了進(jìn)一步了解Pyk2在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中的功能,分別用Pyk2抑制劑水楊酸鈉抑制Pyk2活性和抗Pyk2抗體顯微注射的方法處理卵母細(xì)胞后,觀察生發(fā)泡破裂和極體排放的情況。

參考文獻(xiàn)

[1]Studies on protein tyrosine phosphorylation in mouse oocyte aturation.Kimura H.Nippon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi.1996

[2]Fertilization signaling and protein-tyrosine kinases.Sato K,Tokmakov AA,Fukami Y.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol.2000

[3]Knockdown of the cAMP-dependent protein kinase(PKA)Type Ialpha regulatory subunit in mouse oocytes disrupts meiotic arrest and results in meiotic spindle defects.Duncan FE;Moss SB;Williams CJ.Dev Dyn.2006

[4]An increase of intracellular free Ca2+is essential for spontaneous meiotic resumption by mouse oocytes.De Felici M,Dolci S,Siracusa G.J Exp Zool.1991

[5]孟小倩.酪氨酸激酶Pyk2在大鼠和小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中的定位和功能研究[D].山東師范大學(xué),2007.