背景^[1][2][3][4]

PKCα抗體(兔單抗)中蛋白激酶C的α（PKCα）是一種酶，在人中由編碼PRKCA基因。蛋白激酶C（PKC）是絲氨酸和蘇氨酸特異性蛋白激酶家族，其可被鈣和第二信使二?；视图せ?。PKC家族成員磷酸化多種蛋白質(zhì)靶標，并且已知其參與多種細胞信號傳導(dǎo)途徑。PKC家族成員也是佛波醇酯的主要受體，一類腫瘤促進劑。PKC家族的每個成員具有特定的表達譜，并且被認為在細胞中發(fā)揮獨特的作用。該基因編碼的蛋白質(zhì)是PKC家族成員之一。

據(jù)報道，該激酶在許多不同的細胞過程中發(fā)揮作用，例如細胞粘附，細胞轉(zhuǎn)化，細胞周期檢查點和細胞體積控制。小鼠的敲除研究表明，這種激酶可能是心肌收縮力和肌細胞內(nèi)Ca 2+處理的基本調(diào)節(jié)因子。蛋白激酶C-α（PKC-α）是蛋白激酶家族的特定成員。這些酶的特征在于它們能夠?qū)⒘姿峄鶊F添加到其他蛋白質(zhì)中，從而改變它們的功能。PKC-α已在許多生物的組織中廣泛研究，包括果蠅，爪蟾，牛，狗，雞，人，猴，小鼠，豬和兔。目前正在進行許多研究，研究該酶的結(jié)構(gòu)，功能和調(diào)節(jié)。關(guān)于該酶的最新研究包括其一般調(diào)節(jié)，肝功能和心臟功能。

與該家族中的其他激酶相比，PKC-α在其調(diào)節(jié)模式中是獨特的。通常，蛋白激酶家族受變構(gòu)調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)分子的結(jié)合影響酶的構(gòu)象變化，從而改變酶的活性。然而，PKC-α調(diào)節(jié)的主要模式涉及其與細胞膜的相互作用，而不是與特定分子的直接相互作用。細胞膜由磷脂組成。在較溫暖的溫度下，由于分子內(nèi)運動增加，磷脂以更流動的狀態(tài)存在。細胞膜越流暢，PKC-α的活性越大。在較低溫度下，發(fā)現(xiàn)磷脂處于固態(tài)并具有收縮運動。隨著磷脂變得靜止，它們在膜內(nèi)呈現(xiàn)特定的取向。相對于膜以不規(guī)則或成角度取向固化的磷脂可降低PKC-α的活性。

細胞膜的組成也可以影響PKC-α的功能。鈣離子，鎂離子和二?；视停―AG）的存在是最重要的，因為它們影響膜的疏水結(jié)構(gòu)域。這三種組分的不同濃度構(gòu)成疏水結(jié)構(gòu)域的更長或更短的長度。具有長疏水結(jié)構(gòu)域的膜導(dǎo)致活性降低，因為PKC-α更難以插入膜中。在低濃度下，疏水結(jié)構(gòu)域較短，使PKC-α易于插入膜中并且其活性增加。PKCα活化的增加與癌癥的生長和侵襲有關(guān)。高水平的PKCα與惡性腦癌有關(guān)。此外，膠質(zhì)瘤腫瘤細胞的高增殖率是同工酶PKCα過表達的結(jié)果。PKCα抗體(兔單抗)是將PKCα蛋白注入兔體內(nèi)進行免疫程序，再提取兔血中的抗體最后再進行層析純化。

研究應(yīng)用^[5]

PKCα抗體(兔單抗)可用于PKCα-Nrf2-HO-1信號通路在兔內(nèi)毒素休克急性肺損傷中作用的研究。研究方法血紅素氧合酶-1(HO-1)被認為是對抗氧化應(yīng)激、炎性刺激等適應(yīng)性的細胞反應(yīng),HO-1代謝產(chǎn)物中的膽紅素具有強大抗炎、抗氧化性,有肺臟保護作用,但是有關(guān)誘導(dǎo)HO-1表達上調(diào)的機制尚不清楚,因此明確其誘導(dǎo)表達機制,對內(nèi)毒素休克肺損傷的防治具有十分重要的指導(dǎo)意義。

轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)具有抗炎、抗氧化,抑制細胞凋亡等多重生物活性,Nrf2是一種重要轉(zhuǎn)錄因子,在提供細胞保護、維系細胞生存方面具有重要意義,屬于基本亮氨酸拉鏈的一個子集,其廣泛存在于機體組織細胞中。與抗氧化反應(yīng)序列元件(ARE)共同構(gòu)成Keapl-Nrf2/ARE通路;而蛋白激酶C(PKC)為蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶,是一種磷脂、Ca2+所依賴的蛋白激酶,參與細胞的分化、增殖、凋亡、遷移、細胞支架組構(gòu)等,并承擔著跨膜信號傳遞等重要作用,其機制是誘導(dǎo)了多種蛋白質(zhì)上的Thr/Ser磷酸化。

PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是高度保守三級激酶級聯(lián)傳遞信號通路,發(fā)生低血壓性休克時,啟動該通路,可減少血液動力學(xué)的大幅波動,維持生命體征相對平穩(wěn)。PKCα屬傳統(tǒng)或者說是典型的PKC(classicalor conventional PKC,CPKC),隸屬于A組中一個亞類,其激活的標志通常認為就是PKCα發(fā)生了轉(zhuǎn)位。它可以活化Nrf2,促使其移入細胞核,從而發(fā)揮上調(diào)HO-1表達的作用。

目前,關(guān)于PKCα-Nrf2-HO-1在內(nèi)毒素休克急性肺損傷作用的研究尚未見相關(guān)報道。本研究擬通過建立內(nèi)毒素休克肺損傷模型并應(yīng)用相關(guān)通路阻斷劑及誘導(dǎo)劑來評價PKCα-Nrf2-HO-1通路在兔內(nèi)毒素休克急性肺損傷中的作用,為日后相關(guān)研究提供理論依據(jù)。目的本研究擬探討PKCα-Nrf2-HO-1通路在兔內(nèi)毒素休克誘發(fā)急性肺損傷中的作用。

方法健康清潔級新西蘭大白兔70只,雌雄不拘,2月齡,體重2.0~2.5 kg,采用隨機數(shù)字表法,隨機分為7組(n=10):空白對照組(C組)、模型組(M組)、PKC阻斷劑白屈菜赤堿+模型組(CHE+M組)、PKC誘導(dǎo)劑豆蔻酸佛波酰乙酯+模型組(PMA+M組)、PKC阻斷劑白屈菜赤堿組(CHE組)和PKC誘導(dǎo)劑豆蔻酸佛波酰乙酯組(PMA組)、溶媒二甲亞砜組(DMSO組)。

CHE+M組、CHE組腹腔注射白屈菜赤堿(Chelerythrine,CHE)8mg/kg(溶于0.5ml DMSO),PMA+M和PMA組腹腔注射豆蔻酸佛波酰乙酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)0.02 mg/kg(溶于0.5ml DMSO),C組腹腔注射生理鹽水0.5ml,其余各組以同樣方式注射DMSO 0.5 ml。M組、CHE+M組和PMA+M組30min后耳緣靜脈注射LPS 5 mg/kg(溶于2 ml生理鹽水)制備內(nèi)毒素休克急性肺損傷模型,其余各組注射生理鹽水2ml。

耳緣靜脈注射LPS后兩小時后,右頸總動脈置管所監(jiān)測的各組平均動脈壓變化至原始值的75%及以下,即可認為模型建立成功。在脂多糖注射到達6小時后處死各組的實驗兔,采集右頸總動脈血樣3.5 ml并取肺組織。留取肺組織行病理學(xué)觀察并進行病理評分,測定肺組織W/D比率、SOD活性及MDA含量,檢測血清TNF-α和IL-10濃度以及肺組織Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、Nrf2總蛋白、Nrf2核蛋白、PKCα蛋白、HO-1蛋白的表達。

結(jié)果與C組比較,M組、PMA+M組和CHE+M組肺組織病理學(xué)評分、TNF-α和IL-10濃度、W/D比率、MDA含量升高,Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、Nrf2總蛋白、Nrf2核蛋白及HO-1蛋白的表達上調(diào),SOD活性降低(P均<0.05);M組和PMA+M組PKCα蛋白水平表達上調(diào)(P<0.05),CHE+M組則差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);CHE組、PMA組、DMSO組上述各指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

與M組比較,CHE+M組肺組織病理學(xué)評分、TNF-α濃度、W/D比率、MDA含量升高,Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、Nrf2總蛋白、Nrf2核蛋白、PKCα蛋白及HO-1蛋白的表達下調(diào)(P<0.05),IL-10濃度、SOD活性降低(P<0.05);PMA+M組肺組織病理學(xué)評分、TNF-α濃度、W/D比率、MDA含量降低,Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、Nrf2總蛋白、Nrf2核蛋白、PKCα蛋白及HO-1蛋白的表達上調(diào)(P<0.05),IL-10濃度、SOD活性升高(P<0.05)。

與CHE+M組比較,PMA+M組肺組織病理學(xué)評分、TNF-α濃度、W/D比率、MDA含量降低,Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、Nrf2總蛋白、Nrf2核蛋白、PKCα蛋白及HO-1蛋白的表達上調(diào)(P<0.05),IL-10濃度、SOD活性升高(P<0.05)。結(jié)論PKCα-Nrf2-HO-1通路減輕了兔內(nèi)毒素休克誘發(fā)急性肺損傷,機制可能與肺組織HO-1表達上調(diào)有關(guān)。

參考文獻

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[5] PKCα-Nrf2-HO-1信號通路在兔內(nèi)毒素休克急性肺損傷中的作用[D]. 劉國艷.天津醫(yī)科大學(xué) . 2015