背景及概述[1][2]
左旋肉堿( L-肉堿) 作為一種營養(yǎng)強化劑，被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、臨床醫(yī)療等領(lǐng)域。右旋肉堿( D-肉堿) 為L-肉堿的手性同分異構(gòu)體，已被證實對人體有害，可造成肌肉酸痛嚴(yán)重可致肌肉萎縮。目前，通過純化學(xué)合成以及右旋肉堿再利用等手段生產(chǎn)的L-肉堿中均含有一定的右旋肉堿，其中化學(xué)合成法因成本低、效益高而成為L-肉堿的主要制備方法。在嬰幼兒奶粉中，L-肉堿已成為一種普遍添加的營養(yǎng)強化劑。建立右旋肉堿檢測分析方法，對保障嬰幼兒奶粉質(zhì)量安全具有重要意義。
應(yīng)用[2-3]
右旋肉堿( D-肉堿) 為L-肉堿的手性同分異構(gòu)體，已被證實對人體有害，可造成肌肉酸痛嚴(yán)重可致肌肉萎縮。此外，其可作為醫(yī)藥合成中間體：
1）制備肉堿。肉堿也稱肉毒堿，商品名又稱康胃素，維生素BT，是一種具有多種生理功能的化合物，是人體所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。目前，肉堿除作為營養(yǎng)強化劑用于嬰兒和體弱多病者、作為藥物用于降低血脂、減肥和治療心血管疾病、肝病、糖尿病、急性氨中毒及神經(jīng)系統(tǒng)疾病外，還作為食品和飲料添加劑以及飼料添加劑。肉堿分為左旋和右旋，只有左旋肉堿才具有生物活性，右旋肉堿完全無活性，且還會抑制左旋肉堿的利用。以工業(yè)上沒用的副產(chǎn)右旋肉堿為原料合成肉堿，原料便宜易得，為綠色合成工藝，具體步驟為：右旋肉堿為原料，在酸存在下，以手性酸為催化劑，在極性溶劑中發(fā)生外消旋化反應(yīng)，高收率地得到混旋肉堿，其中，反應(yīng)溫度為50~100℃，反應(yīng)時間為1~10小時。本發(fā)明采用手性誘導(dǎo)的外消旋化反應(yīng)技術(shù)來合成肉堿，收率和含量高，生產(chǎn)成本低，為一種綠色的合成工藝。
2）制備降血脂功能肽，其分子量為620?1200Da，該功能肽的制備方法為：蠶蛹粉預(yù)處理：向蠶蛹粉中加入正己烷和石油醚混合液，加熱回流，即得蠶蛹蛋白；向蠶蛹蛋白粉中加入蒸餾水，混合均勻，加入堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶，再加入右旋肉堿，酶解，滅酶，冷卻后離心，上清液即為酶解液，備用；將酶解液經(jīng)超濾膜得到超濾酶解液，然后將超濾酶解液依次經(jīng)凝膠柱層析、離子交換樹脂層析、和高效液相色譜純化，即得降血脂功能肽。有益效果為：本發(fā)明降血脂功能肽能下調(diào)多數(shù)成脂基因，降低脂質(zhì)堆積，發(fā)揮降血脂作用，可開發(fā)為降血脂藥品、保健產(chǎn)品和食品添加劑。
含量測定[1]
液相色譜-熒光法( HPLC-FLD) 測定嬰幼兒奶粉中風(fēng)險因子右旋肉堿( D-肉堿)，條件為體積分?jǐn)?shù)20%乙醇溶液( H3PO4 調(diào)pH 2.7 ～ 2.8) ，超聲提取20 min，pH 6.0，40 ℃衍生10 min。同時，對目標(biāo)分析物通過熒光檢測波長全掃描，確定了激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長328 nm。該方法的檢出限為5.0 mg /kg，線性范圍0.2 ～ 20.0 mg /L，相關(guān)系數(shù)0.9989，基質(zhì)加標(biāo)回收率68% ～ 80%。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD( n = 5) 小于5%。結(jié)果表明為監(jiān)測嬰幼兒奶粉中風(fēng)險因子D-肉堿提供了可靠、有效的分析手段。具體步驟如下：
1）色譜條件
色譜柱：Waters XBridge TM C18( 250 mm × 4.6mm，5 μm)；流動相：V( 乙腈) ：V( 四氫呋喃) ：V( 50mmol /L pH2.8，KH2PO4緩沖液= 7：6：87；流速：
1.0 mL /min；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。熒光檢
測波長：激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長328 nm。
2）標(biāo)準(zhǔn)溶液
稱取10.0 mg 左旋肉堿和右旋肉堿于10 mL容量瓶，無水乙醇溶解并定容，配制成1.0 mg /mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于4 ℃冰箱。
3）樣品提取和衍生
提取稱取5.0 g 奶粉樣品于150 mL 三角瓶中，加入提取液( 體積分?jǐn)?shù)20% 乙醇溶液，H3PO4調(diào)pH 至2.7 ～ 2.8) 50 mL，搖勻溶解，超聲提取20 min，轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶中，用提取液多次洗滌三角瓶并合并轉(zhuǎn)入容量瓶，定容到刻度。定量濾紙過濾，棄去前10 mL 濾液，收集后段濾液。衍生移取5.0 mL 濾液于100 mL 燒杯中，置于電爐上加熱至近干，用10 mL 無水乙醇分3 次漩渦溶解，合并轉(zhuǎn)移至50 mL 高速離心管中， 12000r /min 高速離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)入到100 mL雞心燒瓶中， 45 ℃旋轉(zhuǎn)濃縮至約0.5 mL。向雞心燒瓶中分別加入0.5 mL 6 g /L 氯甲酸丁酯三氯甲烷溶液、0.5 mL 5 g /L 三乙胺三氯甲烷溶液、0.5 mL4.5 g /L L-丙氨酸-β-萘胺乙醇溶液，漩渦混勻后于40 ℃水浴10 min，取出后加入2 mL 50 mmol /LNaHCO3溶液終止反應(yīng)，振蕩提取5 min 后靜止1 min，移取上層于5 mL 容量瓶中，重復(fù)提取2 ～3次，合并，水定容至刻度。漩渦2 min 后14000 r /min離心1 min，取上清液于過膜上機分析。
主要參考資料
[1] 液相色譜-熒光法測定嬰幼兒奶粉中右旋肉堿
[2] CN200410068172.9 肉堿的合成工藝
[3] CN201810138028.X以蠶蛹為原料制備的降血脂功能肽