背景及概述

膠原蛋白是生物高分子材料，為動(dòng)物結(jié)締組織的主要成分，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功能性蛋白，占蛋白質(zhì)總量的30%左右；具有良好的生物相容性、低免疫原性和組織可降解吸收性，在創(chuàng)面止血、愈合，缺損組織的填充、修復(fù)及重建，藥物載體和組織工程等方面有廣泛應(yīng)用，是理想的醫(yī)用生物材料。膠原蛋白主要從動(dòng)物肌腱、皮膚、尾巴等組織中提取獲得的，具有良好生物相容性、低免疫原性和降解性等特性，但缺乏足夠的機(jī)械強(qiáng)度。交聯(lián)改性或與其他生物材料復(fù)合使用均可改善膠原蛋白的機(jī)械性能。目前，膠原蛋白已被廣泛應(yīng)用于止血?jiǎng)┡c創(chuàng)面敷料、生物補(bǔ)片、骨修復(fù)材料、藥物釋放載體及作為組織工程支架等方面；臨床使用顯示，膠原蛋白對缺損組織的修復(fù)、再生及重建有著顯著促進(jìn)作用。膠原蛋白類軟組織修復(fù)產(chǎn)品如下圖：

圖1 膠原蛋白類軟組織修復(fù)產(chǎn)品

膠原蛋白的來源

天然膠原蛋白來源廣泛，主要存在于動(dòng)物的肌腱、骨、皮膚、韌帶等組織中。目前應(yīng)用較廣的還是以天然獲取的膠原為主，一般從牛、豬、鼠、魚類等動(dòng)物的肌腱、真皮和尾巴中提取[1]。膠原蛋白的提取方法有酸法、堿法、鹽法、酶法等。堿法提取易導(dǎo)致膠原蛋白變性且會(huì)發(fā)生消旋反應(yīng)，一般醫(yī)用膠原蛋白不采用此法。因組織材料中可溶性膠原蛋白含量較少，提取率不高，鹽法提取也較少使用。有研究發(fā)現(xiàn)堿法和鹽法提取的膠原蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，沒有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。目前，采用酸法和酶法結(jié)合提取膠原蛋白的應(yīng)用較多。酸性溶劑如乙酸等，可使組織溶脹，打開其交聯(lián)鍵，利于膠原蛋白的提??；同時(shí)，酶制劑如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等具有專一性，可切斷膠原分子N及C端的非膠原性肽，而不改變?nèi)菪Y(jié)構(gòu)。受動(dòng)物疾病如瘋牛病、口蹄疫等影響，魚類等水產(chǎn)類膠原蛋白的研究應(yīng)用越來越受到關(guān)注。目前，天然膠原仍是膠原蛋白原料的主要來源。

人工合成膠原雖然天然來源的膠原蛋白應(yīng)用廣泛，但其難以修飾，并可能產(chǎn)生致病和免疫不良反應(yīng)及其批次間的差異性問題，人工重組合成膠原蛋白成為一種新的途徑。重組類人膠原蛋白是采用生物基因工程技術(shù)將膠原蛋白的基因片段，借助工具酶拼接到適合的載體然后轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)得到，具有質(zhì)量可控、加工性強(qiáng)、水溶性好、周期性短、較低排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，常見的宿主表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌、酵母菌等。此外，人工化學(xué)合成膠原蛋白也是一種來源。研究發(fā)現(xiàn)這種人工合成仿生膠原纖維可以黏附和激活血小板，形成凝塊，促進(jìn)愈合，不引起炎癥反應(yīng)，具有作為止血?jiǎng)┑臐摿Α?/p>

膠原蛋白的生物學(xué)特性

免疫原性膠原蛋白的氨基酸為(Gly-X-Y)n周期排列，分子結(jié)構(gòu)重復(fù)性高，因此雖然是大分子物質(zhì)，但其抗原性較低，免疫排斥反應(yīng)較少。但膠原蛋白仍然會(huì)引起免疫反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)牛跟腱來源的Ⅰ型膠原蛋白連續(xù)注射BALB/c小鼠3周，66.8mg/kg劑量即可引起脾淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)，可能導(dǎo)致偶發(fā)肝、肺損傷。目前降低膠原蛋白抗原性的方法主要有酶法和超低溫凍存等。酶法主要是采用蛋白酶消化去除膠原蛋白中具有抗原性的終端肽結(jié)構(gòu)。在200MPa、25℃條件下處理10min，膠原蛋白抗原性降低了42.66%；胰蛋白酶在37℃、pH=8.0，酶與底物質(zhì)量比為1∶10時(shí)，膠原蛋白抗原性減少97.69%。超低溫凍存可使抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變及丟失，顯著降低組織抗原性和免疫原性。有研究比較了液氮凍存中不同保護(hù)劑及降溫方式對心臟瓣膜組織免疫原性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同時(shí)含有二甲基亞砜和硫酸軟骨素凍存液中的組織免疫原性最低，此外程序控溫比直接降溫方式能獲得更低免疫原性。膠原蛋白的免疫原性去除，仍然是材料專家和臨床醫(yī)生關(guān)注的重點(diǎn)內(nèi)容之一。

生物相容性和降解性膠原蛋白因其組成和生物特性表現(xiàn)出了良好的生物相容性，與細(xì)胞周圍環(huán)境有著和諧的相互作用機(jī)制，可較好地促進(jìn)人體缺損組織的修復(fù)并能夠參與新生組織的重建過程。將酸-酶法提取的牛跟腱膠原蛋白進(jìn)行生物安全性研究，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)純化的膠原蛋白無全身毒性，未引起接觸性皮膚過敏反應(yīng)，無熱源反應(yīng)，細(xì)胞毒性為Ⅰ級(jí)，此方法提取的膠原蛋白具有較高的安全性。有研究發(fā)現(xiàn)，重組人膠原納米纖維血液相容性良好，無細(xì)胞毒性；細(xì)胞支架復(fù)合培養(yǎng)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，支架材料能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的黏附與增殖，細(xì)胞相容性良好；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出低的炎癥反應(yīng)，具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。同時(shí)，膠原蛋白具有穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)，多數(shù)蛋白酶僅能切斷膠原蛋白側(cè)鏈，但膠原蛋白酶等則能破壞膠原蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)，將其水解為小分子的多肽和氨基酸。膠原蛋白在體內(nèi)降解主要受基質(zhì)金屬蛋白酶影響，關(guān)乎到組織的發(fā)育、形成、重塑與修復(fù)等重要過程。研究發(fā)現(xiàn)受植入部位復(fù)雜的組織微環(huán)境和宿主反應(yīng)影響，膠原蛋白在不同植入部位的降解速率有明顯差異，這對平衡生物支架降解率與機(jī)體組織再生速度具有重要意義。有研究制備了一種薄的機(jī)械性能穩(wěn)定的非交聯(lián)膠原蛋白細(xì)胞載體，植入大鼠皮下42d，膠原蛋白載體完全被降解吸收，被自體組織替代，創(chuàng)面愈合過程中沒有發(fā)現(xiàn)包囊、瘢痕形成或長期血管化和炎癥。

參考文獻(xiàn)

[1] Avila RM, Rodriguez BL, Sanchez ML. Collagen: A review on its sources and potential cosmetic applications J Cosmet Dermatol. 2018;17(1):20-26.