背景及概述

膠原蛋白是生物高分子材料，為動物結締組織的主要成分，是哺乳動物體內含量最多、分布最廣的功能性蛋白，占蛋白質總量的30%左右；具有良好的生物相容性、低免疫原性和組織可降解吸收性，在創(chuàng)面止血、愈合，缺損組織的填充、修復及重建，藥物載體和組織工程等方面有廣泛應用，是理想的醫(yī)用生物材料。膠原蛋白主要從動物肌腱、皮膚、尾巴等組織中提取獲得的，具有良好生物相容性、低免疫原性和降解性等特性，但缺乏足夠的機械強度。交聯(lián)改性或與其他生物材料復合使用均可改善膠原蛋白的機械性能。目前，膠原蛋白已被廣泛應用于止血劑與創(chuàng)面敷料、生物補片、骨修復材料、藥物釋放載體及作為組織工程支架等方面；臨床使用顯示，膠原蛋白對缺損組織的修復、再生及重建有著顯著促進作用。膠原蛋白類軟組織修復產品如下圖：

圖1 膠原蛋白類軟組織修復產品

膠原蛋白的來源

天然膠原蛋白來源廣泛，主要存在于動物的肌腱、骨、皮膚、韌帶等組織中。目前應用較廣的還是以天然獲取的膠原為主，一般從牛、豬、鼠、魚類等動物的肌腱、真皮和尾巴中提取[1]。膠原蛋白的提取方法有酸法、堿法、鹽法、酶法等。堿法提取易導致膠原蛋白變性且會發(fā)生消旋反應，一般醫(yī)用膠原蛋白不采用此法。因組織材料中可溶性膠原蛋白含量較少，提取率不高，鹽法提取也較少使用。有研究發(fā)現(xiàn)堿法和鹽法提取的膠原蛋白三級結構被破壞，沒有完整的三螺旋結構。目前，采用酸法和酶法結合提取膠原蛋白的應用較多。酸性溶劑如乙酸等，可使組織溶脹，打開其交聯(lián)鍵，利于膠原蛋白的提??；同時，酶制劑如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等具有專一性，可切斷膠原分子N及C端的非膠原性肽，而不改變三螺旋結構。受動物疾病如瘋牛病、口蹄疫等影響，魚類等水產類膠原蛋白的研究應用越來越受到關注。目前，天然膠原仍是膠原蛋白原料的主要來源。

人工合成膠原雖然天然來源的膠原蛋白應用廣泛，但其難以修飾，并可能產生致病和免疫不良反應及其批次間的差異性問題，人工重組合成膠原蛋白成為一種新的途徑。重組類人膠原蛋白是采用生物基因工程技術將膠原蛋白的基因片段，借助工具酶拼接到適合的載體然后轉移到宿主細胞中誘導表達得到，具有質量可控、加工性強、水溶性好、周期性短、較低排斥反應等優(yōu)點，常見的宿主表達系統(tǒng)有大腸桿菌、酵母菌等。此外，人工化學合成膠原蛋白也是一種來源。研究發(fā)現(xiàn)這種人工合成仿生膠原纖維可以黏附和激活血小板，形成凝塊，促進愈合，不引起炎癥反應，具有作為止血劑的潛力。

膠原蛋白的生物學特性

免疫原性膠原蛋白的氨基酸為(Gly-X-Y)n周期排列，分子結構重復性高，因此雖然是大分子物質，但其抗原性較低，免疫排斥反應較少。但膠原蛋白仍然會引起免疫反應，研究發(fā)現(xiàn)牛跟腱來源的Ⅰ型膠原蛋白連續(xù)注射BALB/c小鼠3周，66.8mg/kg劑量即可引起脾淋巴細胞免疫反應，可能導致偶發(fā)肝、肺損傷。目前降低膠原蛋白抗原性的方法主要有酶法和超低溫凍存等。酶法主要是采用蛋白酶消化去除膠原蛋白中具有抗原性的終端肽結構。在200MPa、25℃條件下處理10min，膠原蛋白抗原性降低了42.66%；胰蛋白酶在37℃、pH=8.0，酶與底物質量比為1∶10時，膠原蛋白抗原性減少97.69%。超低溫凍存可使抗原結構發(fā)生改變及丟失，顯著降低組織抗原性和免疫原性。有研究比較了液氮凍存中不同保護劑及降溫方式對心臟瓣膜組織免疫原性的影響，結果發(fā)現(xiàn)同時含有二甲基亞砜和硫酸軟骨素凍存液中的組織免疫原性最低，此外程序控溫比直接降溫方式能獲得更低免疫原性。膠原蛋白的免疫原性去除，仍然是材料專家和臨床醫(yī)生關注的重點內容之一。

生物相容性和降解性膠原蛋白因其組成和生物特性表現(xiàn)出了良好的生物相容性，與細胞周圍環(huán)境有著和諧的相互作用機制，可較好地促進人體缺損組織的修復并能夠參與新生組織的重建過程。將酸-酶法提取的牛跟腱膠原蛋白進行生物安全性研究，動物實驗發(fā)現(xiàn)純化的膠原蛋白無全身毒性，未引起接觸性皮膚過敏反應，無熱源反應，細胞毒性為Ⅰ級，此方法提取的膠原蛋白具有較高的安全性。有研究發(fā)現(xiàn)，重組人膠原納米纖維血液相容性良好，無細胞毒性；細胞支架復合培養(yǎng)體外實驗發(fā)現(xiàn)，支架材料能促進成纖維細胞的黏附與增殖，細胞相容性良好；體內實驗表現(xiàn)出低的炎癥反應，具有促進創(chuàng)面愈合的作用。同時，膠原蛋白具有穩(wěn)定的三螺旋結構，多數(shù)蛋白酶僅能切斷膠原蛋白側鏈，但膠原蛋白酶等則能破壞膠原蛋白的螺旋結構，將其水解為小分子的多肽和氨基酸。膠原蛋白在體內降解主要受基質金屬蛋白酶影響，關乎到組織的發(fā)育、形成、重塑與修復等重要過程。研究發(fā)現(xiàn)受植入部位復雜的組織微環(huán)境和宿主反應影響，膠原蛋白在不同植入部位的降解速率有明顯差異，這對平衡生物支架降解率與機體組織再生速度具有重要意義。有研究制備了一種薄的機械性能穩(wěn)定的非交聯(lián)膠原蛋白細胞載體，植入大鼠皮下42d，膠原蛋白載體完全被降解吸收，被自體組織替代，創(chuàng)面愈合過程中沒有發(fā)現(xiàn)包囊、瘢痕形成或長期血管化和炎癥。

參考文獻

[1] Avila RM, Rodriguez BL, Sanchez ML. Collagen: A review on its sources and potential cosmetic applications J Cosmet Dermatol. 2018;17(1):20-26.