背景及概述^[1][2]

水蛭 (Leech)，俗稱螞蟥，屬環(huán)節(jié)動物門蛭綱，體型呈扁平紡錘形。水蛭人藥在我國最早記載 于 2000 多年前東漢時期的藥物學(xué) 專著《神農(nóng)本草經(jīng)》，我國中醫(yī)認為水蛭具有破血逐淤通經(jīng)的功效，主要于治療血瘀經(jīng)閉、瘢瘕痞塊、跌打損傷。水蛭素 (H irudin) 是水蛭 的活性成分。1884 年，英國威爾士國家醫(yī)學(xué)院的?？死蛱?H aycraf t) 博士首先發(fā)現(xiàn)醫(yī)蛭咽部具有抗 熱的水溶性抗凝血物質(zhì)。1904 年，英國科學(xué)家雅各比(Jacoby) 成功地把這種抗凝 血有效成分分離出來，并命名為“水蛭素”。

蛭是活血化瘀類動物藥材的代表藥，應(yīng)用于臨床已有悠久歷史，可明顯改善血瘀成功提取并廣泛應(yīng)用于臨床，量效關(guān)系明確，與肝素、阿司匹林等傳統(tǒng)的抗凝藥物相比，水蛭素用量小，療效高，不良反應(yīng)少而輕，重組水蛭素已成為一種新型的抗凝、防栓藥物。然而，由于臨床應(yīng)用重組水蛭素還存在一定的風(fēng)險，如產(chǎn)生免疫原性及出血危險等；而且，作為抗凝血酶藥物，重組水蛭素預(yù)防動脈血栓的效果并不理想。對其進行分子修飾，以期延長半衰期、降低出血風(fēng)險已成為研究的熱點。

結(jié)構(gòu)

天然水蛭素是一條含 65 或 66 個氨 基酸殘基組成的單鏈多肽，分子質(zhì)量為 7 kD，其 N 末端有 3 對二硫鍵(Cys6-Cysl4，Cysl6-Cys28，Cys32 -Cys39 )，使肽鏈繞疊成密集形核心環(huán)肽結(jié)構(gòu)，對蛋白結(jié)構(gòu)起穩(wěn)定作用。其 N 末端含活性中心，能識別底物-凝血酶堿性氨基酸富集位點，并與之結(jié)合。

C末端富含酸性氨基酸殘基，最后 9 個氨基酸 中有 6 個為酸性氨基酸。天然水蛭素第 63 位的酪氨酸殘基被硫酸化，而重組水蛭素沒有這個特殊的結(jié)構(gòu)，因此后者抗凝 比活性有所下降。水蛭素肽鏈中部有一個由Pro-Lys -Pm 組成的特殊序列，不被一般蛋白酶降解，這有助于維持水蛭素分子的穩(wěn)定性。

應(yīng)用^[1]

1. 心腦血管疾病

隨著介入心臟病學(xué)突飛猛進的發(fā)展，藥物洗脫支架(drug —eluting stent，D ES ) 的出現(xiàn)使冠心病支架置入術(shù)后支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生率降低至 10％，然而涂層藥物降低支架再狹窄率的同時，也影響到內(nèi)皮細胞的愈合而導(dǎo)致血管內(nèi)皮化延遲，進而激活血小板、活化凝血酶，增加晚期致命性支架內(nèi)血栓形成的風(fēng)險。

任曉霞等 通過觀察水蛭素對體外培養(yǎng)的兔血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞生長的影響，認為中等濃度水蛭素與現(xiàn)有藥物支架涂層藥物復(fù)合使用既可以預(yù)防支架內(nèi)再狹窄，又可以通過抑制凝血酶作用而發(fā)揮預(yù)防晚期支架 內(nèi)血栓 的風(fēng)險

2. 急性彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC )

用 48 只家兔 D IC 模型進行重組水蛭素抗 D IC 的研究，結(jié)果表明，重組水蛭素有強抗 DIC 作用，并呈明顯劑量依賴關(guān)系，其抗 D IC 的有效劑量低，作用強度為肝素的 2 倍以上。24 例男性健康志愿者靜脈注射脂多糖(LPS )2 m g/kg，誘發(fā) DIC，隨后分為實驗組與對照組進行，治療結(jié)果顯示，對照組凝血酶一抗凝血酶Ⅲ復(fù)合物(TAT ) 和D-D二聚體明顯高于實驗組，提示水蛭素有治療 DIC 功效 。

3. 皮膚瘢痕

通過觀察水蛭素對皮膚增生性瘢痕成纖維細胞 bF-GF 及 TGFp 表達的影響，表明水蛭素可下調(diào)TG m RNA 和蛋白水平表達，同時上調(diào) bFGF 的 mRNA 和蛋白水平表達，作用呈劑量依賴性，水蛭素對瘢痕有治療效果。通過觀察不同濃度水蛭素對體外培養(yǎng) H SFb 的影響，表明水蛭素對H SFb 的增殖有抑制作用，水蛭素能增加 Bax 表達，抑制 Bcl-2表達，實驗濃度水蛭素對 HSFb 有顯著的抑制作用。

4. 腎臟疾病

重組水蛭素能夠減少 腎小球內(nèi)纖維蛋白相關(guān)抗原沉積，減輕腎小球系膜細胞增殖和腎小球硬化，減輕蛋白尿和低蛋白血癥，改善腎功能。研究證實，轉(zhuǎn)化生長因子-B(TGF -B1) 表達增加與細胞外基質(zhì)(ECM )沉積增加相一致，TGF -pB1是腎小球硬化的主要介質(zhì)。水蛭素可顯著抑制 OX-LD L 誘導(dǎo)活化巨噬細胞導(dǎo)致的系膜細胞 TGF-B 和 FNm RN A 表達上調(diào)，提示水蛭素可能通過抑制系膜細胞TG F B 和FN 的過度表達而抑制腎硬化的發(fā)生。

劑型研究^[1]

目前的新藥研究領(lǐng)域，開發(fā)一個全新的藥物十分困難，研究熱點大都集中在對現(xiàn)有藥物的分子改造或是結(jié)構(gòu)修飾上，同時設(shè)法降低毒副作用。針對在臨床應(yīng)用中所出現(xiàn)的問題，將重組水蛭素類多肽藥物進行各種類型的結(jié)構(gòu)修飾，以期降低良反應(yīng)。

目前水蛭素的類似物包括 RGD-重組雙功能水蛭素、多功能融合水蛭素、聚乙二醇修飾水蛭素?，F(xiàn)用于臨床的水蛭素注射劑還存在一系列問題：半衰期較短，對純度要求較高，易經(jīng)腎排泄，經(jīng)常注射給患者帶來不便。人們正在研究一些非注射給藥途徑，包括肺部、氣管、鼻腔、口腔黏膜、直腸以及口服給藥 。

制備 ^[4]

     方法1：從菲牛蛭活體中提取天然水蛭素的方法。

該發(fā)明是將清洗干凈的菲牛蛭用誘導(dǎo)物質(zhì)充分喂飽菲牛蛭，然后對菲牛蛭進行擠壓使其分泌出唾液（水蛭素粗品），所采用的誘導(dǎo)物質(zhì)包括無機鹽、有機酸和濃度較低的無機酸。具體方法是先配置好純凈的混合水溶液，讓菲牛蛭充分吃飽，然后對其進行擠壓，使其分泌出唾液，每隔一周或10天提取一次，每條鮮活菲牛蛭可以反復(fù)提取6-7次，每次能提取水蛭素粗品6-7毫升左右。

方法2：從天然水蛭中提取高抗凝活性水蛭素的方法。

該發(fā)明是將氯化鈉、一水乙酰半胱氨酸鹽酸鹽、賴氨酸、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的兩種或多種物質(zhì)進行組合，溶解于去離子水中配制成刺激液。將活體水蛭稱重后置于容器中，按水蛭重量比刺激液體積為1∶1～5倍加入所述刺激液，刺激3小時使水蛭分泌分泌液，分泌液經(jīng)過16000～20000r/min離心分離得水蛭素粗品，經(jīng)0.2微米不銹鋼膜微濾，再經(jīng)10000～3000道爾頓分子量的有機膜超濾，再進行反滲透納濾濃縮，然后按固體比液體的重量體積比為1：6～10加入藥用淀粉調(diào)配，經(jīng)噴霧干燥，得水蛭素成品。

主要參考資料

[1] 張和韡, 王麗萍. 水蛭素的研究進展[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志, 2013, 14(1): 76-78.

[2] 胡哲, 張靜. 水蛭素的應(yīng)用研究進展[J]. 包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2014, 30(3): 152-154.

[3] 黃勝, 熊偉, 姚俊杰, 等. 水蛭素提取純化研究進展[J]. 中國生化藥物雜志, 2017, 37(02): 313-315.

[4] 周維官;劉晶;吳玉琴. 一種吸血水蛭活體多次提取天然水蛭素方法. CN201210493449.7，申請日20121128